Vam3对香烟烟雾诱导肺上皮细胞自噬的影响及作用机理研究

发布时间：2018-12-18 17:20

【摘要】：慢性阻塞性肺疾病(Chronic Obstructive Pulmonary Disease, COPD)是危及全球人类健康的重大疾病。目前,慢性阻塞性肺疾病是第四位最常见的死亡原因,仅次于心脏疾病,也是第二位造成劳动力丧失的重要原因。基于慢性阻塞性肺疾病严重影响人类健康,且发病机制尚未明确,因此在其预防、诊断和治疗上还存在很大的缺口,现有的临床治疗药物中也存在长期的副作用或难吸收等各种各样的问题。随着近几年对氧化应激机制研究的深入,一些抗氧化剂也相继问世,并表现出能够改善慢性阻塞性肺疾病患者的症状,延缓疾病进展等方面的作用。因此研发出高效低毒易吸收的抗氧化剂具有较好的商业前景。本研究的目的就是针对慢性阻塞性肺疾病的氧化应激机制环节,评价白藜芦醇二聚体衍生物—Vam3对香烟烟雾诱导的氧化应激导致肺部自噬形成的影响,以期开发出优于白藜芦醇的抗氧化剂。本研究通过体内体外实验首次证明了Vam3可通过抑制香烟烟雾诱导的自噬过度激活而发挥防治慢性阻塞性肺疾病的作用。首先,用不同浓度的烟雾凝集物处理人支气管上皮细胞不同时间,通过Western Blot与免疫荧光方法检测自噬标志性蛋白LC3的表达,发现自制的烟雾凝集物能够诱导人支气管上皮细胞过度自噬,且300mg/L烟雾凝集物处理细胞12小时诱导的自噬最为明显,后续实验均以此浓度和时间为处理条件。其次,我们采用自噬抑制剂巴佛洛霉素处理细胞,并与烟雾凝集物联合应用,通过Western Blot检测自噬相关蛋白LC3和p62的表达,进一步显示了烟雾凝集物能够显著诱导人支气管上皮细胞产生自噬。我们以白藜芦醇为阳性对照药,通过Western Blot和免疫荧光法观察到Vam3能够抑制烟雾凝集物诱导的自噬,1μmol/L浓度尤为显著,且抑制作用优于白藜芦醇。为了探讨Vam3抑制自噬的分子作用机制,我们用IP, Western Blot方法检测了Sirt1和Fox03a的表达及活性,实验结果显示烟雾凝集物处理细胞后,Sirt1的表达及活性水平均下调,而Vam3能够上调或维持Sirt1的表达及活性。另外,烟雾凝集物能够下调总FoxO3a和磷酸化FoxO3a的表达,促进FoxO3a入核,并上调其乙酰化水平,而Vam3则能逆转FoxO3a的上述改变,且作用效果好于白藜芦醇。为了进一步验证Vam3是否是通过Sirt1发挥作用的,我们敲降人支气管上皮细胞中Sirt1的表达发现,Vam3几乎不能够逆转自噬的过度激活。此外,我们通过检测细胞内ROS及GSH-Px的含量发现,Vam3能够抑制烟雾凝集物诱导的氧化应激反应。体内实验我们建立了熏烟小鼠模型,病理切片HE染色显示Vam3能够改善熏烟小鼠肺部的病理变化。肺组织均浆的Western Blot检测及肺组织石蜡切片的免疫组化检测均显示Vam3能够抑制熏烟小鼠肺部的自噬,并逆转香烟烟雾诱导的Sirt1和FoxO3a表达下调。综上所述,本文首次发现了Vam3具有抗氧化、抗自噬的作用,且作用效果优于白藜芦醇；Vam3可通过抑制氧化应激反应和调节Sirtl/FoxO3a通路,抑制香烟烟雾诱导的自噬激活,进而发挥防治慢性阻塞性肺疾病的作用。本研究也为进一步开发出防治COPD的抗氧化药物提供了理论依据和可靠的先导物。
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【学位授予单位】：北京协和医学院
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2012
【分类号】：R563.9;R285

【参考文献】