人脐带间充质干细胞治疗内毒素诱导大鼠急性肺损伤的实验研究

发布时间：2019-08-20 13:32

【摘要】：目的：急性肺损伤(Acute Lung Injury, ALI)及其严重形式急性呼吸窘迫综合征(Acute Respiratory Distress Syndrome, ARDS)在脓毒症等危重病人中的发病率和死亡率极高,目前,对ALI的研究主要集中在ALI相关炎症细胞、细胞因子、黏附因子的相互作用、表达调控等方面,虽然取得了一定的成果,但其发病机制仍未阐明。ALI的治疗主要是支持性治疗,尚未找到特效治疗措施,死亡率高达40%,亟需探索新的治疗方法,因而成为医学研究人员亟待突破的重大医学难题之一。最新研究发现,骨髓间充质干细胞(Bone Marrow Mesenchymal Stem Cells, BM-MSCs)具有多向分化、免疫调节和旁分泌特性,不仅能够归巢至损伤组织、在受损组织中抑制免疫反应及炎性反应,还具有向多种组织细胞分化的潜能,在创伤修复、组织功能再生与重建、免疫调节与治疗等研究领域应用前景广阔。多个动物实验研究表明,BM-MSCs可通过抗炎、抗凋亡和免疫调节等作用,减轻内毒素引起的急性肺损伤,改善肺功能,提高生存率,为急性肺损伤治疗提供了新的方法与思路。然而,作为MSCs经典来源的骨髓组织随着年龄增长存在干细胞含量和增殖能力降低、操作过程易造成感染等问题,寻找理想来源的间充质干细胞十分必要。间充质干细胞(Mesenchymal Stem Cells, MSCs)在几乎所有组织和器官中均可提取,其在免疫调节及低免疫源性方面的优点与其来源无关。与BM-MSCs相比,脐带间充质干细胞(Umbilical Cord Mesenchymal Stem Cells,UC-MSCs)具有获取方便、易提取、细胞量大、增殖率高、更安全等优点,目前尚无UC-MSCs治疗内毒素肺损伤的报道。本研究拟首先比较BM-MSCs和UC-MSCs的细胞形态、细胞表型、分化能力和免疫能力,并采用全基因组表达芯片比较二者的功能基因表达情况,然后通过注射内毒素制备大鼠肺损伤模型,验证人UC-MSCs输注能否通过抑制炎症反应、抑制氧化应激等减轻内毒素致肺损伤,并提高生存率方法： 1)间充质干细胞的培养和鉴定：原代培养人BM-MSCs和UC-MSCs,并通过形态学观察和流式细胞术鉴定这两种细胞的一般特征；使用β-甘油磷酸钠、TGF-p和胰岛素等化学诱导方法诱导两种MSCs向成骨、软骨和脂肪细胞方向诱导分化,利用茜素红S、油红O和甲苯胺蓝染色等方法鉴定其多向分化功能； 2)利用芯片分析MSCs的基因表达：分别提取BM-MSCs和UC-MSCs的RNA,通过人全基因组表达基因芯片对这两种细胞的基因组表达和微小RNA表达情况进行比较分析,并对差异表达的基因进行GO功能聚类分析； 3)脓毒症急性肺损伤模型的制作：选择SD大鼠60只,随机分为四组：对照组、LPS组、Fibroblast+LPS组和MSC+LPS组即治疗组,每组15只,按照10mg/kg体重腹腔内注射LPS,制造脓毒症急性肺损伤模型,并进行常规病理切片、支气管肺泡灌洗液、肺湿干比和血清炎症因子TNF-α、IL-1β、IL-6的ELISA分析。 4) UC-MSCs输注治疗肺损伤：LPS注射致肺损伤1小时后,MSC+LPS组尾静脉注射含5×105脐带间充质干细胞的生理盐水300μl,Fibroblast+LPS组注射含5×105人成纤维细胞(MRC-5细胞系)的生理盐水300μl,其余两组注射等量生理盐水。并分别于输注治疗后6小时、24小时和48小时每组处死3到5只大鼠,收集血浆、肺组织,进行常规病理切片、支气管肺泡灌洗液中性粒细胞计数及蛋白定量、肺湿干比和血清炎症因子TNF-α、IL-1β、IL-6的ELISA分析,并检测肺组织氧化损伤指标MDA含量,以及HO-1酶的活性和蛋白Western Blotting定量分析。结果： 1)我们所培养的骨髓和脐带MSC均可旺盛增殖,呈现典型的成纤维状细胞形态,表达CD29、CD44、CD73、CD90、CD105和CD166等典型的MSC细胞表面抗原,不表达CD31、CD34和CD45等造血和内皮细胞标志,在诱导后可向造骨、软骨和脂肪细胞分化,并表达其特异性标志。 2)通过基因芯片和生物信息学分析,与UC-MSCs相比,BM-MSCs表达更多的免疫反应相关基因,而UC-MSC更多的表达器官发育和生长等早期发育相关基因。KEGG信号通路分析同样证明BM-MSCs高表达免疫相关信号通路。在UC-MSCs中的高表达的前3个miRNA分别是miR-519e*、miR-518a-5p和miR-520d-5p。而BM-MSCs则高表达miR-373*、miR-492、miR-498和miR-409-5p,这些miRNA的靶基因均主要与肿瘤发生有关。 3)腹腔注射LPS6小时后,肺组织病理表现为明显的毛细血管扩张充血,中性粒细胞明显增多,并于24小时达到高峰,同时出现肺泡间隔明显增厚直至48小时仍不能有效缓解。腹腔注射LPS后24小时肺组织湿干比明显升高,48小时逐渐恢复减轻。在中性粒细胞浸润方面,LPS腹腔注射后支气管肺泡灌洗液中中性粒细胞于24小时和48小时有明显升高,而肺组织MPO活性也同时明显升高。经过LPS处理造模,LPS导致大鼠血浆中的促炎因子TNF-α、IL-1β、IL-6浓度明显升高并于刺激6小时后达到高峰,于24小时和48小时逐渐下降。 4)脐带间充质干细胞治疗后肺组织表现出一定程度的肺损伤,但严重程度在三个时间点均较单纯LPS损伤组明显减轻。而人肺成纤维细胞治疗不能改善LPS诱发的肺损伤病理改变。脐带间充质干细胞治疗后,24小时肺湿干比明显改善。支气管肺泡灌洗液蛋白浓度是检测肺毛细血管内皮和肺泡上皮通透性的重要指标,LPS引起支气管肺泡灌洗液蛋白浓度迅速升高,并于24小时达到高峰,MSC+LPS组在各时间点灌洗液蛋白浓度虽均有降低,但未达到统计学差异。在中性粒细胞浸润和肺组织MPO活性方面：MSC+LPS组与LPS组相比两者均明显下降。脐带间充质干细胞治疗明显降低了LPS诱发的全身炎症反应,血浆中的促炎因子浓度TNF-α、IL-1β、IL-6在治疗后6小时即明显下降,在此后的24和48小时均低于LPS损伤组。LPS同样引起各时间段抗炎因子IL-10血浆浓度的明显升高,脐带间充质干细胞治疗没有影响IL-10血浆浓度的升高。 5)肺组织MDA水平是氧化损伤程度的标志,LPS腹腔注射后各时间点MDA均明显升高,而MSC+LPS组与LPS组相比MDA各时间点均明显下降。我们还检测了损伤24小时各组HO-1的蛋白表达及活性水平,结果显示对照组HO-1有轻微表达,而LPS注射后肺组织HO-1表达明显增强,脐带间充质干细胞治疗后HO-1表达进一步增强。HO-1活性水平与此相似。 6)在生存率方面,脐带间充质干细胞治疗组48小时生存率明显高于单纯损伤组,分别为87%和60%,治疗组大鼠生存率提高了20%,而人肺成纤维细胞对LPS诱导肺损伤生存率没有改善作用。结论： 1)骨髓和脐带均可获得MSC,符合国际上对MSC的界定标准,但UC-MSCs的增殖能力明显高于BM-MSCs,且同样具有多向分化能力。BM-MSCs的免疫抑制能力虽然高于UC-MSCs,但不具有显著性差异； 2)静脉注射脐带间充质干细胞明显提高了内毒素肺损伤模型大鼠的生存率。脐带间充质干细胞明显降低了血中促炎因子TNF-α、IL-1β、IL-6水平,对IL-10无影响,减轻了内毒素引起的全身炎症反应。脐带间充质干细胞可通过减轻肺水肿、减少中性粒细胞肺部浸润等明显改善内毒素肺损伤。促进抗炎与抑炎反应平衡、减轻氧化应激可能是脐带间充质干细胞治疗作用的基础。
【学位授予单位】：山东大学
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2012
【分类号】：R563.8

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