白细胞去除术对内毒素血症犬肺损伤的影响及机制研究

发布时间：2019-11-04 05:38

【摘要】：急性肺损伤（acute lung injury，ALI）和急性呼吸窘迫综合征（acute resp iratorydistress syndrome，ARDS）是由多种炎性介质及效应细胞共同参与，并呈级联放大的瀑布样炎症继发性弥漫性肺实质损伤、以肺-血屏障通透性升高导致富蛋白液渗出和顽固的低氧血症为特征的临床综合征，尽管应用先进的重症监护及治疗，并改进了治疗策略，ALI/ARDS迄今仍具有高发病率及高病死率。数十年来，众多针对ALI/ARDS的预防和治疗努力收效甚微。迄今，ALI/ARDS仍是临床危重病学研究的热点和难点。因此，对于ALI/ARDS或ALI/ARDS高风险患者迫切需要发展一种新的预防和治疗策略。目前公认，肺内中性粒细胞扣押、渗出和引起的肺炎性损害在ALI/ARDS的发生发展中起到了关键的作用，中性粒细胞活化并产生的各种有害介质介导了ALI/ARDS时肺的炎性损害，其中，中性粒细胞弹性蛋白酶是中性粒细胞中最重要的酶类炎性介质，在ALI/ARDS的发生中起最为重要的作用。循环血白细胞，特别是中性粒细胞升高，是各种细菌性脓毒症最重要的特征，国内外既往的研究已证实，中性粒细胞在死于脓毒症ALI/ARDS患者的支气管肺泡灌洗液中远较未死亡者为高。由于肺及支气管肺泡灌洗液中的中性粒细胞来源于循环血，我们推测，抑制或部分去除循环血中白细胞可能会成为新的ALI/ARDS预防和治疗的有效手段。既往在体的研究证实，通过抑制循环血中的中性粒细胞，可减少受试动物肺病理损伤，最近一项去除大鼠内毒素血症循环血白细胞的研究也取得了类似的结果。上述针对体内所有白细胞及中性粒细胞的技术尽管可以减轻受试动物的炎性损伤，但均来自于小的啮齿动物，同时，上述通过抗体或细胞毒性药物抑制或破坏体内白细胞，存在严重副作用及感染风险，难以用于临床防治脓毒症ALI/ARDS。白细胞去除术是一种通过特定装置在体或离体去除血液中部分白细胞、以减少白细胞炎性损伤为目的治疗技术，在欧洲广泛用于难治性自身免疫性疾病，本研究拟通过白细胞去除术去除内毒素血症犬部分循环血WBC和PMN的数量，观察减少循环血PMN对内毒素血症犬急性肺损伤的影响，，从而为ALI/ARDS的临床防治开劈新的思路及方法。目的观察白细胞去除对内毒素血症犬急性肺损伤预防作用及机制；探讨白细胞去除术在脓毒症患者中潜在临床应用意义。方法24只健康雄性杂种犬以数字随机表法分为内毒素组（LPS组）、伪去白细胞组（sham组）、白细胞去除组（LCAP组）（n=8）。动物麻醉、监测、机械通气和血管准备完成、且血液动力学稳定后，各组动物均静脉泵入LPS (2mg/kg; E. coliO55:B5)造内毒素血症模型。LCAP组在LPS输注开始后16h，以连续血流血细胞分离机和单核细胞程序（MNC）分离循环血白细胞，据受试动物体重、身长、血细胞压积和目标白细胞水平设置参数分离周期数、血流速。分离过程中监测外周血白细胞计数水平适当调整分离周期数，并据白细胞收集袋中白细胞计数监测结果评估分离效果。sham LCAP执行操作和程序同LCAP组，但通过将白细胞收集袋中分离物持续回输入血进行伪白细胞去除。选择16h行白细胞去除是基于预实验中发现，静脉输入LPS后，白细胞迅速下降，6-8小时后开始回升，约在16小时后恢复至正常水平。目标白细胞计数(8.0×109/L)确定系基于预实验中所测（10只健康受试犬种）的白细胞计数(8.36-16.4×109/L)下限水平。为稳定血液动力学，适量给予输液或血管活性药物。试验时测定外周血WBC和PMN计数、血清中性粒细胞弹性蛋白酶（NE）和髓过氧化物酶（MPO）的基础水平、并在LPS输注0、2、8、16、20、24和36小时重复测定。外周血标本收集后4℃、3000转离心10分钟，收集上清液立即冻存于-80℃备测NE及MPO（酶联免疫吸附法，ELISA）。LPS输注后36h放血处死动物，立即剖胸取右中肺叶行支气管肺泡灌洗并收集支气管肺泡灌洗液（BALF），3ml用于立即检测BALF中WBC和PMN计数，余液分装后于-80℃冻存备测NE。同时右下肺叶尖部用锋利刀片切取数块分别固定于4%多聚甲醛和2.5%戊二醛中分别行普通病理、肺实质细胞凋亡、扫描和透射电镜检查。同法另取左下肺叶数块备测肺实/干重比、肺核因子-κBp65(NF-κB subunit p65)和肿瘤坏死因子-α(TNF-α)（Western Blot及ELISA法）。统计学方法采用SPSS13.0:计量资料数据以均数±标准差(x±s)表示，数据采用重复测量资料方差分析或单因素方差分析，组间的两两多重比较采用LSD法；计数资料采用χ2检验，P0.05为差异具有统计学意义。结果 1．ALI/ARDS发生率：LPS输注后36h，LPS组、Sham组、LCAP组分别有7（7/8）、7（7/8）和3（3/8）例受试犬发生ALI（p0.05），无ARDS发生。ALI发生的时间19h-36h，平均31h。 2．LPS及LCAP对循环血白细胞及中性粒细胞计数的影响：LPS输注后循环血WBC及PMN计数迅速下降，PMN比例明显降低，6-8h后WBC计数及PMN逐渐上升，约16h后WBC恢复至基础水平，然后进一步上升，同时PMN比例升高； LCAP组16h时开始行LCAP，持续约4h，结果显示，与LPS及sham组比较，LCAP可明显降低外周血WBC及PMN计数，此趋势持续4小时以上（20h: p0.01;24h:p0.05），同时，各组动物间WBC及PMN计数均值亦有显著性差异，LCAP组明显低于LPS及sham组（p0.05）。而LPS与Sham组间比较无显著差异性。 3．LPS和LCAP对血清NE水平的影响： LPS输注后血清NE水平持续升高，LCAP部分去除循环血WBC和PMN后，血清NE水平绝对值并无下降，但LCAP结束时及4h后LCAP组血清NE水平仍明显低于LPS和Sham组（20h: p0.01;24h:p0.05），比较受试动物各时间点NE均值，LCAP组亦低于LPS和Sham组（p0.05）。 4．各组间BALF蛋白浓度、肺NF-κB含量改变：LCAP组BALF蛋白浓度、肺实质凋亡细胞数及肺NF-κB含量均明显低于LPS组及Sham组（p0.01或p0.05）。LCAP组肺间质水肿相对较轻，但BALF中PMN计数、肺实质内PMN数量、TNF-α及MDA水平均无明显差异（p0.05）。 5．肺组织普通病理观察及肺组织内中性粒细胞计数(/10HP)：各组犬肺组织均可见中性粒细胞微血管内扣押、肺实质内浸润。LPS组、Sham组及LCAP三组间肺组织中性粒细胞计数无显著性差异(27.3±5.4,24.9±4.1vs22.6±4.7)(p0.05)，但LCAP组肺间质水肿相对较轻。 6．肺实质凋亡细胞观察：三组间肺实质凋亡细胞计数（/HP）有显著性差异：LCAP组明显低于LPS组和Sham组（91.0±9.5vs101.8±10.2和104.8±11.1)(p0.05)，LPS组和Sham组间肺实质凋亡细胞计数无明显差异(p0.05). 7．发生与未发生ALI动物循环血PMN及NE观察：发生ALI受试动物循环血PMN及NE均显著高于未发生ALI(P0.05). 8．PMN、NE与氧合指数：平均循环血PMN计数与平均血清NE水平呈正相关，二者与受试犬36小时之氧合指数呈负相关，均有统计学意义(P0.01)。结论 1．杂种犬是内毒素血症ALI/ARDS模型较为理想的受试动物：杂种犬体形较大，白细胞及动脉血气分析指标与人类接近，内毒素血症后达到ALI/ARDS诊断标准需要较长时间，与人类ALI/ARDS发病病程较接近，受试犬ALI发生前后可给予机械通气及其它生命支持处理。其ALI/ARDS诊断标准可采用临床标准，克服了小动物发生ALI/ARDS后很快死亡、不能进行进一步研究、与人类病程及治疗经过差异过大的局限。 2．LPS诱导的内毒素血症犬循环血白细胞的变化规律：早期中性粒细胞迅速降低，6-8小时后缓慢上升，约16小时后恢复至基础水平；并随时间进一步升高。 3．去除白细胞的方法及标准。本研究证实，在充分临床保障的基础上，人用血白细胞分离机可用于内毒素血症杂种犬分离白细胞。本研究去除白细胞时机、循环血白细胞目标水平可减轻肺实质损害、降低ALI的发生率。 4．白细胞去除有效减少肺实质损害的可能机制：1）减少循环血中性粒细胞弹性蛋白酶水平；后者对肺气血屏障的损害减轻、对肺泡表面活性物质的分解减少；2）减少肺实质细胞NF-κB表达、进而下调NF-κB调控的各种损害性介质的表达；3）减轻肺实质细胞凋亡。
【学位授予单位】：第三军医大学
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2012
【分类号】：R563.8

【参考文献】