支架蛋白Gab1调控肺泡表面活性蛋白以及LPS介导 急性肺损伤的作用机制研究

发布时间：2020-03-09 06:14

【摘要】：背景：急性肺损伤(acute lung injury, ALI)是由于感染、休克和创伤等多种原因引起的肺部并发症,可进一步发展为急性呼吸窘迫综合征(acute respiratory distress syndrome, ARDs)。临床上以严重低氧血症、弥漫性肺部浸润和肺顺应性下降为特征,其发病机制迄今尚未完全阐明,临床治疗手段也非常有限。Gab1作为支架蛋白与多种酪氨酸磷酸酶受体相偶联,在分子信号通路传导过程中起重要作用。在急性肺损伤中很多基因发现与上皮细胞损伤/凋亡相关联,但支架蛋白Gab1在调控肺泡或者上皮细胞稳态过程中研究依然未知。 目的：利用Cre/LoxP系统建立肺泡ⅡI型上皮细胞特异性Gab1基因敲除小鼠并进行初步表型分析,并在急性肺损伤过程中研究Gab1在维持肺泡表面活性稳态中的作用。 实验方法：本研究选择了肺泡Ⅱ型上皮细胞特异性表达反式激活元件的转基因小鼠(SPCrtTA)作为介导敲除的工具鼠,将其与表达(TetoCre)重组酶的转基因小鼠交配获得了SPCrtTA-TetoCre双转基因小鼠,接着用SPCrtTA-TetoCre双转基因小鼠与Gab1条件基因打靶小鼠交配获得了可诱导型肺泡Ⅱ型上皮细胞特异性Gab1基因敲除小鼠,三重转基因小鼠在强力霉素的诱导下使得Gab1在肺泡Ⅱ型上皮细胞中发生特异性缺失,肺泡Ⅱ型上皮细胞Gab1基因敲除小鼠无胚胎致死,能够顺利出生。Gab1在肺泡上皮细胞的表达通过mRNA水平和蛋白水平进行评估,LPS通过气道给药的方式对肺泡造成强烈的损伤,急性肺损伤的程度则通过组化以及酶联免疫吸附等试验进行检测。实验结果检测方式： (1)强力霉素给药7天,诱导小鼠Gab1在肺泡Ⅱ型上皮细胞中缺失后以体积描记法确定小鼠肺动态顺应性(Cdyn). (2)小鼠进行右侧支气管肺泡灌洗,灌洗液(BALF)收集1hr内取0.2ml,用白细胞计数液倍比稀释后进行白细胞计数。用酶联免疫吸附法检测BALF中的IL-1,IL-6, TNF-alfa等炎症因子水平。 (3)取未灌洗的肺组织,经过10%甲醛溶液中固定,漂洗、脱水、透明和石蜡包埋。切片常规化蜡、梯度酒精下入水,进行HE染色。 (4)提取小鼠肺组织蛋白,用免疫印迹电泳方法观测肺表面活性蛋白(SPA,SPB,SPC,SPD)表达情况。 (5)小鼠气道内滴注LPS24hr后,检测BALF中白细胞总数,肺组织病理以及肺泡表面活性蛋白表达。 (6)采取两组间均数t检验,P0.05为有显著性差异,P0.01为有非常显著性差异。实验结果：肺组织切片后HE染色结果显示Gab1敲除小鼠肺组织形态基本正常,模型组符合ALI改变；Gab1敲除小鼠肺动态顺应性降低,肺泡表面活性蛋白表达降低,且并未引起炎症反应。LPS刺激,Gab1敲除小鼠引起一个更为严重的炎症反应,白细胞计数表明炎症细胞明显增多,BALF中炎症因子表达上升,Realtime-PCR结果表明肺泡Ⅱ型上皮细胞中肺泡表面活性蛋白表达显著降低。 结论 1,本研究成功建立了肺泡Ⅱ型上皮细胞特异性Gab1基因敲除小鼠 2,小鼠肺泡Ⅱ型上皮细胞Gab1的缺失降低了肺泡表面活性蛋白的表达同时也影响了小鼠正常的肺功能 3,在LPS诱导的急性肺损伤反应过程中,肺泡Ⅱ型上皮细胞Gab1的缺失诱发更为严重的炎症反应
【学位授予单位】：浙江大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2012
【分类号】：R563.8

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本文编号：2585745