【摘要】：目的 1.建立卵清蛋白致敏/激发肺部变应性炎症小鼠模型,为进一步实验打下基础。 2.探讨卵清蛋白致敏/激发哮喘小鼠肺脏病理及肺泡灌洗液(BALF)的细胞形态 和分子生物学改变,初步分析哮喘变应性炎症的发病机制。 方法 20只4-6周龄雌性BALB/c小鼠随机分为两组,每组10只,实验组应用卵清蛋白于第0、14天致敏,第24-26天激发小鼠,对照组用生理盐水。末次激发结束后48小时处死小鼠,留取血清、肺脏病理、肺泡灌洗液、肺脏冰冻组织等标本,比较两组肺脏病理变化,及肺泡灌洗液内细胞计数和细胞分类计数。 结果 1.致敏/激发组小鼠肺脏病理组织学改变符合变应性炎症表现。 2.与正常对照组小鼠相比,致敏/激发组小鼠的BALF中细胞总数显著增多,细胞分类计数结果表明嗜酸性粒细胞、淋巴细胞比例明显增多。 3.致敏/激发组小鼠BALF和血浆中IL-4水平明显升高,而IFN-Y水平显著下降。 结论 1.采用卵清蛋白致敏/激发小鼠,成功建立了小鼠哮喘模型。 2.通过对血清及肺泡灌洗液中各种细胞因子的测定,证实哮喘免疫紊乱类型是Thl/Th2比例失衡,Th2细胞增多及其分泌的各种细胞因子在哮喘的发生发展中具有重要作用。 目的 1.分离、培养小鼠骨髓间充质干细胞(BMSCs),为进一步的实验提供实验材料。 2.观察骨髓间充质干细胞的形态变化,流式细胞术鉴定细胞表面标志物,初步了解骨髓间充质干细胞的特性。 方法 无菌状态下完整分离小鼠下肢股骨和胫骨,提取骨髓腔内细胞,红细胞裂解液裂解无核的红细胞,将骨髓有核细胞至于37℃,5%CO2培养箱中培养。通过反复换液去除悬浮细胞,通过多次传代可以除去贴壁的巨噬细胞和成纤维细胞,达到骨髓间充质干细胞的纯化。取P2代细胞行流式细胞仪检测细胞表面标记CD29、CD34、CD44的表达。 结果 1.显微镜下,骨髓间充质干细胞呈贴壁生长,多为长梭形,在细胞生长旺盛期,形态均一,生长速度快,呈典型的旋涡状克隆样生长。 2.细胞仪分析结果表明P2代细胞中CD29(+)、CD44(+)、CD34(-)细胞纯度95%。 结论 通过反复试验,我们成功分离和纯化了骨髓间充质干细胞,通过反复传代扩增细胞数量,为进一步的实验提供细胞来源。 目的 研究腹腔注射骨髓间充质干细胞是否可以减轻哮喘小鼠肺部的炎症反应,发挥治疗效果,初步探索其可能的作用机制。 方法 实验分为五组： 1.对照组；生理盐水腹腔注射及雾化吸入。 2.哮喘对照组；OVA致敏/激发(方法同第一部分)。 3.哮喘+BMSCs治疗组；每次激发前2小时腹腔注射2ml含1×107个BMSCs的培养液。 4.哮喘+BMSCs培养液治疗组；每次激发前2小时腹腔注射2mlBMSCs的培养液。 5.哮喘+BMSCs裂解液治疗组；每次激发前2小时腹腔注射含2ml含1×107个BMSCs的细胞裂解液。 连续激发三次,木次激发后48小时处死小鼠,收集肺脏病理、肺泡灌洗液、肺冰冻组织等进行分析。 结果 1.与正常对照组相比,哮喘对照组表现出明显的变应性炎症表现。 2.与哮喘对照组相比,BMSCs治疗组显示出明显的治疗作用：肺部变应性炎症反应明显减轻,肺泡及血清中的炎症因子明显下降。 3.与哮喘对照组相比,BMSCs培养液治疗组及BMSCs裂解液治疗组也显示出一定的治疗作用。 4.与BMSCs治疗组相比,BMSCs培养液治疗组及MSC裂解液治疗组治疗作用相对较弱。 5. BMSCs培养液治疗组及BMSCs裂解液治疗组治疗作用基本相似。 6.实验中未观察到明显BMSCs治疗的不良反应。 结论 1.注射BMSCs对急性哮喘炎症有治疗作用,且无明显不良反应。 2. BMSCs培养液及BMSCs裂解液对急性哮喘也有治疗作用,但是该作用与直接注射BMSCs的治疗作用相比较弱。 目的 通过观察与BMSCs共培养后的T淋巴细胞的功能状态,进一步阐述BMSCs治疗哮喘的作用机制。 方法 分离脾脏T淋巴细胞,BMSCs与T淋巴细胞体外共培养,共培养72小时后收集悬浮T细胞及培养液,离心后,上清液测IL-4、IL-17、IFN-γ水平。沉淀后的T细胞提取细胞蛋白,应用Western blot测定蛋白中Lck含量。实验共分为六组： 1.哮喘小鼠T淋巴细胞单独培养； 2.正常小鼠T淋巴细胞单独培养； 3.正常小鼠T淋巴细胞与正常小鼠BMSC在DMEM培养液中共培养； 4.哮喘小鼠T淋巴细胞与哮喘小鼠BMSC在DMEM培养液中共培养； 5.哮喘小鼠T淋巴细胞与正常小鼠BMSC在DMEM培养液中共培养； 6.哮喘小鼠T淋巴细胞与正常小鼠BMSC在哮喘小鼠肺组织匀浆中共培养。 结果 1.各组培养液中IL-4、IL-17、IFN-γ水平无明显差异。 2.第一组哮喘小鼠和第四组与哮喘小鼠BMSCs共培养的哮喘小鼠T淋巴细胞Lck蛋白的表达增多,其他组T淋巴细胞Lck蛋白表达无明显差别。 结论 1. BMSCs通过抑制T淋巴细胞内Lck蛋白的表达抑制其活化,阻断其功能。 2.哮喘小鼠BMSCs功能受损,不能发挥免疫抑制功能。
【学位授予单位】：复旦大学
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2012
【分类号】：R562.25
【共引文献】
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