Imipramine对内毒素诱导的小鼠急性肺损伤的抗炎症、抗凋亡作用的研究

发布时间：2020-03-27 10:19

【摘要】： 实验目的 急性肺损伤(acute lung injury, ALI)的临床发病率和病死率均较高,目前临床各种治疗手段尚未能使其病死率明显下降。本研究以脂多糖(lipopolysaccharide,LPS)诱导小鼠炎症性肺损伤为研究对象,探讨通过imipramine抑制应激状态下神经酰胺生成的关键酶酸性鞘磷脂酶(acid sphingomyelinase, ASMase)是否对急性肺损伤具有保护作用。炎症反应和细胞凋亡是急性肺损伤发生、发展的重要病理过程,本课题就imipramine对LPS诱导的小鼠急性肺损伤中肺组织炎症反应和肺组织细胞凋亡的两方面的影响进行研究并探讨相关分子机制,为通过调节神经酰胺的生成治疗急性肺损伤提供一定的理论依据。 实验方法 采用LPS腹腔注射的方法诱导小鼠急性肺损伤的动物模型,并在LPS诱导前30min给予imipramine干预,按照处理方式的不同分为四组：Sham+imipramine, Sham+vehicle, LPS+ imipramine和LPS+vehicle。记录生存时间,计算不同实验组的生存率；观察不同时间点不同实验组中急性肺损伤各指标(肺组织病理学变化、W／D(Wet/Dry,湿干重比)、MPO (myeloperoxidase,髓过氧化物酶)、肺组织炎症因子mRNA表达、支气管肺泡灌洗液和血清中炎症因子表达和细胞凋亡的指标(Bcl-2和Bax蛋白含量)的变化；通过对NF-κB (nuclear factor kappa B,核因子kappa B)活性和含量、p38、JNK和Txnip (thioredoxin-interacting protein,硫氧还蛋白反应蛋白)蛋白表达的检测,进一步探讨imipramine抑制小鼠急性肺损伤的炎症反应和凋亡的分子机制。 实验结果 1.腹腔注射LPS诱导小鼠炎症性肺损伤,其模型容易复制,肺损伤程度较稳定、均匀,肺组织病理变化也证实符合小鼠急性肺损伤的病理改变。 2.在LPS诱导急性肺损伤前30min给予小鼠imipramine干预可以显著改善急性肺损伤小鼠的生存率(P0.05)。 3.肺组织病理学改变及评分：imipramine的应用改善了LPS诱导的小鼠肺组织的病理损伤,并且通过肺组织损伤病理评分,我们发现imipramine干预在12h(9.65±0.43VS11.9±0.80,P0.05)、18h(11.05±0.73VS14.30±0.39,P0.05)显著降低了急性肺损伤小鼠肺组织病理损伤评分。这表明imipramine可以减轻LPS诱导的肺组织病理损伤。 4.肺组织W／D：LPS诱导小鼠急性肺损伤后,肺组织W／D增加,12h达到高峰5.24±0.11。与LPS+Vehicle组相比,LPS+imipramine组肺组织W／D在6h(4.80±0.04VS5.16±0.05,P0.05)、12h(4.87±0.11VS5.24±0.11,P0.05)和18h(4.77±0.07VS5.14±0.03,P0.05)均显著降低。 5.肺组织MPO活性：LPS诱导小鼠急性肺损伤后,肺组织MPO活性增加,18h达到高峰37.55±5.67Units/min/mg protein。与LPS+Vehicle组相比,LPS+imipramine组肺组织MPO活性在12h(10.10±1.28 Units/min/mg protein VS28.48±7.53 Units/min/mg protein, P0.05)和18h (11.39±1.36 Units/min/mg protein VS37.55±5.67 Units/min/mg protein, P0.05)均显著降低。 6.支气管肺泡灌洗液中炎症因子浓度：TNF-a和IL-10在6h的基础水平分别是218.50±22.11pg/ml,和83.02±15.33pg/ml。LPS刺激后TNF-a和IL-10水平均明显升高。在LPS刺激6h后TNF-α和IL-10水平达到最高峰,分别为3860.31±274.80pg/ml和2809.00±143.70pg/ml。Imipramine干预在6h和12h显著降低了TNF-α(6h：2204.00±242.30VS3860.31±274.80,12h：2236.00±348.0VS3612.00±412.70, P0.05)和IL-10 (6h：1645.00±222.50VS2809.00±143.70,12h：1463.00±137.80VS2117.00±117.20,P0.05)水平。 7.血清中炎症因子浓度：LPS刺激后血清中TNF-α和IL-10的变化趋势与其在支气管肺泡灌洗液中变化趋势相似。TNF-α和IL-10在6h的基础水平分别是228.90±54.72pg/ml,236.55±45.92pg/ml。LPS刺激后TNF-α和IL-10水平均明显升高。在LPS刺激6h后TNF-α和IL-10水平达到最高峰,分别为3619.76±376.30pg/ml和3261.16±484.70pg/ml。Imipramine干预也在6h和12h显著降低了TNF-α(6h：1871.00±435.70VS3619.76±376.30,12h：1250.00±329.40VS2832.00±201.10, P0.05)和IL-10 (6h：1755.00±281.50VS3261.16±484.70,12h：1283.00±153.80VS2221.00±330.00,P0.05)水平。 8.肺组织炎症因子mRNA表达：LPS刺激后肺组织中炎症因子mRNA表达均显著增加。与LPS+Vehicle组相比,LPS+imipramine组肺组织中TNF-αmRNA表达水平在6h和12h显著降低,IL-6 mRNA表达水平在18h显著降低,IL-10mRNA表达水平在6h显著降低。 9.NF-κBp65活性和含量：LPS诱导的小鼠急性肺损伤模型中小鼠肺组织NF-κBp65活性和含量均显著增加,而imipramine干预可以在6h和12h显著抑制LPS诱导的NF-κB p65活性的增加,并在12h显著抑制LPS诱导的NF-κB p65含量的增加。。 10.肺组织凋亡指标：imipramine干预可使Bcl-2蛋白表达量增加,Bax蛋白表达量减少,即imipramine干预可以减轻肺组织凋亡 11.imipramine干预可以显著抑制LPS诱导的pp38、pASK1和Txnip蛋白表达的增加。 结论 1.在LPS诱导急性肺损伤前30min给予小鼠imipramine干预可以显著改善急性肺损伤小鼠的生存率。 2.Imipramine通过抑制NF-κB活性和量的增加抑制LPS诱导的肺部炎症反应。 3.Imipramine是通过抑制Txnip-ASK1-p38MAPK信号传导途径减轻急性肺损伤肺组织细胞凋亡。
【图文】：

一、腹腔注射LPs建立小鼠的急性肺损伤模型按照Kabir等【14，巧]学者报道的方法，经腹腔注射LPS诱导小鼠炎症性肺损伤，建立LPS致急性肺损伤模型，其模型容易建立，肺损伤程度较稳定，诱导过程中未出现动物死亡，安全性和可操作性优于经气管穿刺注入，避免操作相关病原体感染的可能，且更符合临床上急性肺损伤的病理生理改变。急性肺损伤小鼠表现为活动减少、反应迟钝、呼吸加速和毛发凌乱等特征。同时，肺组织病理也证实符合小鼠急性肺损伤的改变。二、生存分析统计每组小鼠的生存情况，观察记录每只小鼠的生存时间，绘制生存分析曲线，结果如图1.1所示，动物死亡主要发生在24h一48h，其他时间则死亡较少。同时行Log一rank方法比较不同组之间生存率有无差异，结果表明imipramine可以明显改善LPS诱导的急性肺损伤小鼠的生存率(57.14%Vsl4.29%，P<0.05)。

图1.3小鼠急性肺损伤肺组织病理评分变化趋势(n=6)。*P<0.05VSsham+vehiclegrouP;#P<0.05VS.LPS+imiPraminegrouP.表1.1肺组织损伤严重程度评分(n=6)组别Sham+imiPrmineSham+vehieleLPS+imiPramineLPS+vehiele0.85士0.250.9肚0.258.35士0.30*8.75士0.38*1.25士0.221.05士0.109.65士0.43*11.9士0.80*#0.55士0.150.35士0.1311.05士0.73*14.30士0.39*#~卜.nU卜n)l摊n”，

本文编号：2602829