GTS-21对铜绿假单胞菌肺炎引起肺损伤的保护性作用及其机制研究
发布时间：2020-03-29 03:24
【摘要】：急性呼吸窘迫综合征(ARDS)是由多种病因引起的难以纠正的急性呼吸衰竭,病理表现为急性肺损伤。铜绿假单胞菌是重症监护病房(ICU)最常见的致病菌之一,肺内感染铜绿假单胞菌可以引起直接性肺损伤。ARDS的治疗一直是临床救治的难点,目前主要还是依靠机械通气(保护性肺通气策略),其死亡率仍然高达40%以上。近年来,胆碱能抗炎通路(CAP)的激活被认为可以抑制炎症反应、减轻肺损伤,甚至可以降低ARDS的死亡率,并已经在部分动物模型上得到验证。α7乙酰胆碱能受体(α7nAChR)是胆碱能抗炎通路的关键一环,它是配体门控离子通道蛋白,广泛分布与中枢和外周神经系统,在神经元和非神经元细胞中表达,参与各种生理反应。α7nAChR激动剂可以激活胆碱能通路,也是目前研究胆碱能抗炎通路的主要靶点之一。GTS-21是一种选择性α7nAChR激动剂,可以激活效应细胞上的α7nAChR,影响细胞的功能,发挥调控炎症作用。研究目的α7nAChR激动剂减轻肺损伤的机制并不完全清楚,特别是对于临床比较常见的由铜绿假单胞菌引起的细菌性肺炎,继而导致的直接肺损伤模型,目前尚未见报道。本研究通过气管内注入铜绿假单胞菌肺炎肺损伤模型,应用GTS-21,研究α7nAChR激活对肺损伤的影响,并结合体外细胞实验,在组织学和分子水平上检测对Ⅱ型肺泡上皮细胞的作用,并探讨其可能的机制。研究方法一建立肺炎肺损伤模型。C57BL/6野生型小鼠,鼠龄8-12周,体重22-26g,共30只,随机分为3组:Control组(n=10):正常对照组,未经任何处理;Sham组(n=10):假手术组,气管内注入无菌生理盐水;Pneumonia(n=10):肺炎组,气管内注入铜绿假单胞菌,建立肺炎模型。建立模型后,观察各组小鼠一般状态,通过体外活体成像,观察小鼠肺内铜绿假单胞菌生长等指标进一步确认肺炎模型。肺损伤评估。观察24小时后,处死小鼠,分别留取新鲜肺组织、肺泡灌洗液(BALF),通过测定BALF中心粒细胞数量,对肺组织切片染色进行肺组织损伤评分、测定肺W/D(湿/干重比)等方法评估肺损伤严重程度。在Sham组和肺炎组,我们还测定了肺泡灌洗液和肺匀浆中炎症因子高迁移率族蛋白B1(HMGB1)的水平二、观察α7nAChR激动剂GTS-21对肺损伤的作用。1、研究α7nAChR激动剂GTS-21对野生型小鼠肺损伤后生存率的影响。C57BL/6野生型小鼠(32只,共4组,每组8只),分别随机分为Sham组:假手术组;肺损伤组:气管内注入铜绿假单胞菌,建立肺炎模型组;肺损伤+GTS-21组:气管内注入铜绿假单胞菌,建立肺炎肺损伤模型,并在注入细菌前2小时腹腔注射GTS-21(4mg/kg)1次,术后每8小时腹腔注射GTS-21(4mg/kg);GTS-21组:假手术组+术前2小时和术后每8小时腹腔注射GTS-21(4mg/kg)。观察小鼠生存率。2、研究α7nAChR基因敲除小鼠和野生型小鼠肺损伤后生存率的影响。野生型和基因敲除小鼠各16只,各分成2组:Sham组(n=8只):假手术组;肺损伤组(n=8只):气管内注入铜绿假单胞菌,造成肺炎肺损伤;观察小鼠生存率。3、研究α7nAChR激动剂GTS-21对小鼠肺损伤后对相应的组织细胞学和分子生物学指标的影响。C57BL/6野生型小鼠(40只,每组10只)和α7nAChR基因敲除小鼠(α7nAChR-/-)(40只,每组10只),分别随机分为Sham组:假手术组;肺损伤组:气管内注入铜绿假单胞菌,建立肺炎肺损伤模型组;肺损伤+GTS-21组:气管内注入铜绿假单胞菌,建立肺炎肺损伤模型,并在注入细菌前2小时腹腔注射GTS-21(4mg/kg)1次,术后每8小时腹腔注射GTS-21(4mg/kg);GTS-21组:假手术组+术前2小时和术后每8小时腹腔注射GTS-21(4mg/kg)。在观察24小时后,处死小鼠。检测指标:1)留取肺泡灌洗液(BALF),离心甩片后观察中心粒细胞和巨噬细胞的数量,检测BALF中炎症因子HMGB1水平;2)留取肺组织经10%福尔马林固定后,包埋切片HE染色,进行肺组织损伤评分比较肺损伤严重程度;3)留取新鲜肺组织,检测其中 HMGB1、p65 NF-Kb,p-κb-α,MAPK p-p38,caspase-3,bcl-2 等蛋白表达。三、GTS-21对TNF-α诱导人Ⅱ型肺泡上皮细胞损伤的作用及其机制。应用Ⅱ型肺泡上皮细胞(A549)和TNF-α建立细胞炎症模型。培养人Ⅱ型肺泡上皮细胞,在含10%胎牛血清的RPMI培养液1640中,在37℃,5%C02饱和度条件下,正常经孵育传代3次以上。随机分为4组:正常对照组(Control):正常培养,不加TNF-α和GTS-21;炎症损伤组:以TNF-α(10ng/ml)刺激细胞,不加GTS-21;炎性损伤+GTS-21组:以TNF-α(10ng/ml)刺激细胞,4小时后予以 GTS-21(75uM);GTS-21 组:仅给予 GTS-21(75uM)。为进一步确认p-p38通路在其中的作用,我们还使用了 p-p38激动剂和α7nAChR受体拮抗剂(α-Bungarotoxin,α-BTx)。所有组细胞均孵育12小时。检测指标:1)MTT测定细胞活性;2)收集细胞培养液,采用ELISA测定细胞培养液中HMGB1、IL-6变化;RIPA裂解细胞提取细胞蛋白,采用Western Blot方法测定细胞裂解液中p65 NF-κb,p-iκb-α,MAPK p-p3 8 等蛋白表达;3)采用TUNEL方法测定上皮细胞凋亡。四、统计方法。结果以均数±标准差(x土SD)的形式,采用SPSS 20.0统计学软件和GraphPad Prism绘图软件进行统计学处理。数据经检验符合正态分布,两组之间采用独立样本t检验,多组之间采用方差分析。如果方差分析结果有显著差异,再两两之间进行Newman-Keuls post hoc分析。当P0.05认为有统计学显著差异,当P0.01认为有统计学非常显著差异。研究结果一、肺损伤模型的建立:气管内注入铜绿假单胞菌后,Control组和Sham组小鼠毛色和饮食正常;而肺损伤组小鼠精神萎靡,进食及饮水明显减少,活动迟缓,体温下降。在肺损伤组,24小时后均可经Living Image系统观察到细菌在小鼠肺内成像。Control组和Sham组未见细菌生长,二者在BALF中中性粒细胞数量、肺损伤评分、肺W/D均无明显差别。与Sham组比较,肺损伤组小鼠:1)BALF里中粒细胞大量聚集,数量较Sham组明显增加(P0.01),炎症因子HMGB1较Sham组升高(P0.05);2)肺损伤组肺组织中HMGB1蛋白表达明显升高(P0.05);3)肺损伤组肺损伤指数明显升高(P0.05)。二、GTS-21对肺损伤的影响1、在WT小鼠中,和肺损伤组比较,肺损伤+GTS-21组小鼠生存率明显提高(P0.05);2、和WT小鼠比较,α7nAChR基因敲除小鼠肺损伤后生存率明显下降(P0.05)。3、在WT小鼠中,与肺损伤组比较,肺损伤+GTS-21组小鼠BALF里中粒细胞数量较肺损伤组较少(P0.05),肺损伤指数降低(P0.05);与肺损伤组比较,肺损伤+GTS-21组小鼠BALF中炎症因子HMGB1水平明显下降,肺组织中HMGB1蛋白表达也低于肺损伤组(P0.05);Western Blot结果表明:与Sham组比较,肺损伤组肺组织p65 NF-Kb,p-iκb-α,MAPK p-p38,caspase-3,表达明显增加(P0.05),bcl-2表达下降(P0.01);而肺损伤+GTS-21组小鼠与肺损伤组比较,肺组织中p65 NF-κb,p-iκb-α,MAPK p-p38,caspase-3,表达明显下降(P0.05),bcl-2 表达升高(P0.01);在α7nAChRKO小鼠,与肺损伤组比较,肺损伤+GTS-21组小鼠BALF里中粒细胞聚集没有明显减少(P0.05),肺损伤指数没有明显改善(P0.05);并且,与WT小鼠比较,α7nAChRKO小鼠肺损伤后肺泡腔内中粒细胞聚集、肺损伤指数明显升高(P0.05);与WT小鼠损伤组比较,α7nAChR KO小鼠肺损伤组p65 NF-Kb,p-iκb-α,MAPK p-p38,caspase-3,表达明显升高(P0.05)。三、细胞实验结果与Control组比较,炎性损伤组MTT结果细胞活力下降(P0.05);而炎性损伤+GTS-21组,MTT结果细胞活力较炎性损伤组明显提高(P0.05)。ELISA结果提示与Control组比较,炎性损伤组细胞培养液中HMGB1和IL-6明显升高(P0.05);而炎性损伤+GTS-21组,HMGB1和IL-6水平较炎性损伤组明显下降(P0.05)。Western Blot结果也提示与与Control组比较,炎性损伤组p65 NF-Kb,p-iKb-α,MAPK p-p38 蛋白表达增加;炎性损伤+GTS-21 组,p65 NF-Kb,p-κb-α,MAPK p-p38较炎性损伤组明显下降(P0.05)。TUNEL测定结果表明与Control组比较,炎性损伤组细胞凋亡增加(P0.05);与炎性损伤组比较,包括TNF-α10ng/ml和TNF-α 20ng/ml,炎性损伤+GTS-21组细胞凋亡都明显减少(P0.05)。研究结论α7nAChR激动剂GTS-21可以改善因铜绿假单胞菌感染导致的急性肺损伤,提高生存率。其机制与通过抑制NF-Kb通路减轻炎症反应,抑制MAPK p-p38通路活性,减少Ⅱ型肺泡上皮细胞凋亡有关。
【图文】：
逡逑粒细胞（图２左）。逡逑Ｎｅｕｔｒｏｐｈｉｌｓ邋ｉｎ邋ＢＡＬＦ邋Ｌｕｎｇ邋ｉｎｊｕｒｙ邋ｓｃｏｒｅ逡逑Ｃ0ｎ，ｏ，邋；逦＇邋＇逡逑－＊逦＂邋－邋；逡逑．？邋？邋？逡逑＿邋＿＿逡逑灥~栧义希福埃埃澹浚义希靛危危卞，
本文编号：2605359
【图文】：
逡逑粒细胞（图２左）。逡逑Ｎｅｕｔｒｏｐｈｉｌｓ邋ｉｎ邋ＢＡＬＦ邋Ｌｕｎｇ邋ｉｎｊｕｒｙ邋ｓｃｏｒｅ逡逑Ｃ0ｎ，ｏ，邋；逦＇邋＇逡逑－＊逦＂邋－邋；逡逑．？邋？邋？逡逑＿邋＿＿逡逑灥~栧义希福埃埃澹浚义希靛危危卞，
本文编号：2605359
本文链接：https://www.wllwen.com/yixuelunwen/huxijib/2605359.html
最近更新
教材专著
