重组CTLA4Ig和CCR7诱导的耐受性树突状细胞治疗哮喘的研究

发布时间：2020-04-04 18:16

【摘要】： 第一部分小鼠CCR7基因克隆目的:从小鼠肺脏克隆出CCR7基因,为下一步利用腺病毒载体AdEasy system构建AdCCR7打下基础。方法:以小鼠肺脏提取的总RNA为模板,设计合成扩增小鼠CCR7基因的特异性引物,加入特定的酶切位点,进行RT-PCR反应。应用胶回收法纯化目的基因CCR7,目的基因定向克隆至载体pMD-19,构建质粒pMD-CCR7,进行测序,与已知GeneBank中的CCR7基因进行序列比较,若有对导致编码氨基酸改变的突变碱基则进行定点突变修复。结果:克隆CCR7基因,序列测定表明CCR7基因有2个碱基突变,但不造成编码氨基酸的改变,无需进行突变碱基定点修复。结论:本研究成功克隆小鼠CCR7基因,确定无造成编码氨基酸改变的突变碱基,无需进行突变碱基定点修复。第二部分构建重组腺病毒AdCTLA4Ig、AdCCR7 目的:应用腺病毒载体系统AdEasy System构建含有CTLA4Ig、CCR7基因的重组腺病毒AdCTLA4Ig、AdCCR7及其对照腺病毒AdGFP,为进一步应用其进行诱导树突状细胞免疫耐受并回归到肺组织的研究打下基础。方法:1.将目的基因CTLA4Ig克隆至穿梭质粒pAdTrack-CMV,碱裂解法提取质粒,酶切使之线性化后与腺病毒骨架质粒pAdEasy-1在BJ5183细菌内进行同源重组,构建重组腺病毒质粒pAdCTLA4Ig。2.将穿梭质粒pAdTrack-CMV直接酶切使之线性化后与腺病毒骨架质粒pAdEasy-1在BJ5183细菌内进行同源重组,构建重组腺病毒质粒pAdGFP。3.将目的基因CCR7克隆至穿梭质粒pAdTrack-CMV,碱裂解法提取质粒,酶切使之线性化后与腺病毒骨架质粒pAdEasy-1在BJ5183细菌内进行同源重组,构建重组腺病毒质粒pAdCCR7。将以上构建的重组腺病毒质粒以PacⅠ酶切法进行鉴定。成功重组的腺病毒质粒用PacⅠ线性化后转染病毒包装细胞HEK293,于荧光显微镜下观察绿色荧光以确定转染效率,用RT-PCR法鉴定构建效果。结果:重组腺病毒pAdCTLA4Ig、pAdGFP和pAdCCR7分别经PacⅠ酶切后可见4.5Kb或3Kb和一条30Kb的条带,表明同源重组成功。将线性化的重组腺病毒质粒转染病毒包装细胞HEK293后于荧光显微镜下可观察到明亮的绿色荧光。将收集的病毒液做RT-PCR鉴定,结果表明重组腺病毒pAdCTLA4Ig、pAdGFP和pAdCCR7构建成功。结论:成功构建了重组腺病毒pAdCTLA4Ig、pAdCCR7及对照腺病毒pAdGFP。第三部分腺病毒转导CTLA4Ig、CCR7基因修饰树突状细胞目的:从小鼠骨髓分离单个核细胞,建立体外原代培养树突状细胞的方法,确定影响树突状细胞成熟的因素和CTLA4Ig、CCR7表达效率,构建稳定表达CTLA4Ig和CCR7基因的树突状细胞疫苗。方法:从小鼠胫骨和股骨冲洗出骨髓,制成细胞悬液,在GM-CSF和IL-4作用下,体外培养7天。光学显微镜下观察细胞生长状况和形态学变化。流式细胞术(FACS)鉴定转染细胞表型,确定为树突状细胞后,感染重组腺病毒并与OVA共同孵育。FACS鉴定细胞成熟状态,荧光显微镜观察细胞内目的基因表达及细胞生长状态,FACS和激光共聚焦技术检测CTLA4Ig和CCR7两种蛋白的表达及共表达情况。结果:50%左右细胞具有CD11c表型,确定为树突状细胞。流式细胞术检测AdCTLA4Ig和AdCCR7共感染的DC蛋白表达情况,约10.86%细胞表达CTLA4Ig,56.99%表达CCR7,10.04%为两种蛋白的共同表达。激光共聚焦技术不仅可以观测到胞膜胞浆还可观测到胞核蛋白的表达。结果显示,约80%以上细胞表达CTLA4Ig,90%以上表达CCR7,75%以上为两种蛋白的共表达,而对照组AdGFP则无表达或低表达.流式细胞术检测结果显示经AdCTLA4Ig和AdCCR7共感染的DC表型CD40、CD80和CD86表达均有所降低,尤其是CD80和CD86下降明显。结论:腺病毒转导基因CTLA4Ig和CCR7修饰DCs可使DCs同时表达两种蛋白分子,而共刺激分子CD40/CD80/CD86表达减少。第四部分重组CTLA4Ig和CCR7诱导的耐受性树突状细胞治疗哮喘的研究目的:通过尾静脉回输AdCTLA4Ig/AdCCR7-DCs,观察其对哮喘小鼠气道炎症和Th失衡的干预作用以及免疫耐受反应是否局限于局部肺组织。方法:SPF级BALB/c小鼠40只,随机分为正常对照组、哮喘模型组、AdGFP-DC对照组和AdCTLA4Ig/AdCCR7-DC干预组。哮喘模型组用OVA致敏和激发;正常对照组用生理盐水代替;AdGFP-DC对照组和AdCTLA4Ig/AdCCR7-DC干预组激发前2个小时分别回输AdGFP-DC和AdCTLA4Ig/AdCCR7-DC,余处理同模型组。观察哮喘的发作情况:肺组织病理切片检测肺部病理损害,支气管肺泡灌洗液检测BALF中白细胞总数及分类,ELISA检测BALF和血清中Th1、Th2类细胞因子,免疫荧光法检测肺、肾、小肠组织CCR7蛋白表达水平。结果:与AdGFP-Dc组小鼠比较,AdCTLA4Ig/AdCCR7-DCs尾静脉回输可明显减轻小鼠的急性哮喘发作症状;减轻气道炎症和嗜酸性粒细胞浸润;减轻肺部病理损害,降低气道局部Th1、Th2类细胞因子,但对血清中细胞因子则无明显调节作用。尾静脉回输AdCTLA4Ig/AdCCR7-DCs组小鼠肺组织CCR7蛋白表达较肾、小肠组织明显增加,较其他组肺组织亦明显增加。结论:尾静脉回输AdCTLA4Ig/AdCCR7-DCs可明显减轻小鼠急性哮喘发作症状,减轻肺部炎症和嗜酸性粒细胞浸润,调节气道局部Th1和Th2细胞因子分泌,但对体液细胞因子的分泌调节作用有限;CCR7的表达可使DC回归肺组织,避免全身免疫耐受的发生。
【图文】：

碱基序列,琼脂糖凝胶电泳,重组技术,引物

5s、18s 和 28s 条带清晰无弥散（图1-1），提示所提取总 RNA 质量较好，无降解现象，可以作为 RT-PCR 的模板。图 1-1 所提总 RNA 琼脂糖凝胶电泳Fig1-1 1％Agarose gel electrophresis of the total RNA2．1．2 RT-PCR 反应在 DNA 克隆重组技术中，外源性目的基因的制备和纯化是重组克隆的基础。尤其是外源性基因两端的设计牵涉到下面的将目的基因连接到质粒载体中。本文在设计目的基因 PCR 扩增引物时，将限制性核酸内切酶 XbaⅠ和 BglⅡ酶切位点设计入其引物的两端，因此 PCR 反应扩增出的 CCR7 基因片段就含有了该两种内切酶的碱基序列。这为下面将 CCR7 目的基因克隆重组入 pAdTrack-CMV 质粒中提供了可供互补连接的粘性末端。经过 PCR 反应，得到的产物在 1％琼脂糖凝胶

逆转录PCR,琼脂糖凝胶电泳,产物,重组技术

图 1-2 逆转录 PCR 产物琼脂糖凝胶电泳Fig1-2 Agarose gel electrophresis of the product2．1．3 目的基因胶回收纯化产物在 DNA 克隆重组技术中，，目的基因的纯化非常重要，而 RT-PCR 产物中不可避免地含有引物二聚体等干扰因素，故需进行胶回收纯化目的基因，为下一步构建质粒打下基础（见图 1－3）。
【学位授予单位】：重庆医科大学
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2008
【分类号】：R562.25

【引证文献】