【摘要】： 第一部分肺功能正常吸烟者和慢性阻塞性肺疾病患者肺组织中白细胞介素17的表达及意义 目的探讨白细胞介素17(IL-17)在肺功能正常吸烟者和慢性阻塞性肺疾病(COPD)患者肺部炎症反应发生机制中的作用。 方法将需手术治疗的周围型肺癌患者分为肺功能正常非吸烟组(NS组,10例)、肺功能正常吸烟组(S组,13例)、吸烟COPD稳定期组(COPD组,10例)。于手术切除标本选取距肺癌病灶5～8cm处的新鲜正常肺组织,酶联免疫吸附试验(ELASA)检测各组肺组织匀浆IL-17含量,HE和维多利亚蓝+范吉逊染色检测各组平均肺泡面积、小气道总病理积分和肺腺泡肌型动脉(MA)管壁厚度,免疫组织化学方法检测IL-17+及CD4+、CD8+T细胞在肺泡壁、小气道壁及MA管壁的表达,分析IL-17表达与CD4+、CD8+T细胞以及与肺实质病理改变和肺功能指标的相关关系。 结果NS组、S组和COPD组肺组织匀浆IL-17含量分别为6.1(3.7～12.4)、9.7(3.5～69.7)和22.7 (7.0～114.4) pg/mg, COPD组明显高于明显NS组(P=0.000),COPD组明显高于S组(P=0.036),S组明显高于NS组(P=0.042)；平均肺泡面积分别为(50708±14125)、(106517±13851)和(152344±43783)μm2,小气道总病理积分分别为(49±10)、(101±34)和(163±36)分,MA管壁厚度分别为(119±11)、(139±25)和(172±28)μm,S组和COPD组均明显高于NS组(P0.05,P0.01),COPD组明显高于S组(P0.05, P0.01)。IL-17主要表达于肺实质浸润的炎症细胞,S组和COPD组肺泡壁、小气道壁及MA管壁IL-17+T细胞均明显多于NS组(均尺0.01),COPD组明显多于S组(均P0.05)。IL-17表达与平均肺泡面积(r=0.561)、MA管壁厚度(r=0.682)、小气道病理总积分(r=0.425)呈显著正相关(均P0.05)。肺泡壁、小气道壁和MA管壁中IL-17表达与CD4+、CD8+细胞呈显著正相关(P0.05,P0.01)。肺组织匀浆IL-17含量与第1秒用力呼气容积占预计值百分比呈显著负相关(r=-0.471,P=-0.006)。 结论IL-17在肺功能正常吸烟者和COPD患者肺组织中表达增高,与肺CD4+、CD8+T细胞及肺组织破坏、气道炎症、肺动脉重构和气流受限密切相关,提示IL-17在吸烟者和COPD患者肺部炎症反应发生机制中有促炎作用。 第二部分辅助T细胞17在肺功能正常吸烟者及COPD患者肺部组织中的活化、分布及作用 目的观察肺功能正常吸烟者和COPD患者肺组织是否存在活化的辅助T细胞(Th)17即CD4+IL-17+细胞,其活化程度以及与IL-17之间的相关关系,探讨肺实质中IL-17是否来源于Th17细胞。分析CD4+IL-17+细胞在肺部的表达及分布并与肺部病理、肺功能指标改变之间做相关分析关系,探讨Th17细胞在COPD炎症反应中的作用。 方法实验病例入选及分组同第一章。荧光定量聚合酶链式反应(PCR)方法检测肺组织匀浆Th17细胞特异性转录因子ROR gamma t(维甲酸相关孤独受体γt)的RNA表达水平,蛋白质印迹(Westerm blot)方法检测肺组织匀浆ROR gamma t蛋白表达水平,免疫荧光双标方法检测Th17细胞在肺泡壁、小气道壁、肺小动脉壁的表达。分析肺组织匀浆中ROR gammat RNA表达水平与IL-17蛋白水平及FEV1占预计值百分比相关性；分析肺组织中Th17细胞与肺气肿、小气道病理总积分、肺小动脉管壁厚度,及与IL-17+、CD4+T淋巴细胞之间相关性。 结果(1)荧光定量PCR结果显示,肺组织匀浆ROR gammat的mRNA表达水平,在NS组为(2.685±0.886),S组(8.564±1.419),COPD组(10.158±1.574),三组间两两比较有显著性差异(P0.01或P0.05)以COPD最为显著。(2) Western blot结果显示肺组织匀浆ROR gamma t蛋白表达水平在NS组(0.369±0.094),S组(0.614±0.241),COPD组90.886±0.184),三组间两两比较有显著性差异(P0.01或P0.05),以COPD组最为显著。(3)免疫荧光双标结果显示,CD4+IL-17+细胞在肺泡壁的表达,S组为(25±7)个／cm,COPD组为(27±4)个／cm较NS组(14±5)个／cm显著性增强(均P0.01),但COPD组与S组比较无显著性差异(P0.05)。在小气道壁的表达,COPD组为(220[81,422])个／mm2较S组(121[22,170])个／mm2及NS组(54[16,258])个／mm2表达增强(P0.05),S组较NS组表达有增强的趋势,但无显著性差异(P0.05)。NS组、S组、COPD组三组在血管壁的表达有增强的趋势但无显著性差异(均P0.05)。(4)肺组织匀浆中ROR gammat RNA与FEV1占预计值百分比呈显著负相关(r=-0.643, p= 0.000), ROR gammat蛋白含量与FEV1占预计值百分比呈显著负相关(r=-0.539,p=0.002),肺组织IL-17蛋白含量与ROR gammat RNA含量呈显著正相关(r=0.678,p=0.000)。(5)肺泡壁中CD4+IL-17+细胞数与平均肺泡面积呈显著正相关(r=0.738,p=0.000),在气道壁中Th17细胞数与气道总病理评分呈显著正相关(r=0.476,p=0.034),在MA管壁中的Th17细胞数与血管壁厚度无显著性相关(r=0.355,p=0.125)。(6)肺泡壁中CD4+IL-17+细胞数与IL-17+、CD4+T淋巴细胞之间相关系数(分别r=0.584,0.646,均P0.01),气管壁中CD4+IL-17+细胞数与IL-17+、CD4+T淋巴细胞之间相关系数(分别r=0.510,0.518,均P0.05),肺小动脉壁CD4+IL-17+细胞数与IL-17+淋巴细胞之间相关系数(r=0.517,P0.05),与CD4+T淋巴细胞无显著性相关(r=0.200,p=0.399)。 结论Th17细胞特异性转录因子ROR gammat mRNA及蛋白水平在正常吸烟者的肺组织已经开始增高,COPD患者更为显著,并与IL-17蛋白含量密切相关；Th17细胞表达增强并与IL-17+细胞、CD4+T淋巴细胞及肺组织破坏、气道和肺动脉炎症与重构、气流受限密切相关。结果提示CD4+T淋巴细胞参与吸烟者和COPD患者肺部炎症免疫反应,肺组织中Th17处于增殖活化状态,并分泌IL-17参与并促进肺部炎症反应。 第三部分Th17细胞及相关因子参与肺功能正常吸烟者和COPD患者肺部炎症的相关机制 目的观察Th17细胞活化的上游因子IL-23受体(IL-23R), CC趋化因子受体6(CCR6)及其分泌的相关因子IL-17、IL-21在肺组织的表达及意义,探讨Th17细胞在COPD肺部炎症中活化及放大炎症反应的可能机制。 方法实验病例入选及分组同第一章。肺组织蜡块病理切片免疫组化技术检测肺泡壁1L-17, IL-23R, CCR6的表达,并分析三者之间及与Th17细胞之间的相关性。荧光定量PCR检测肺组织匀浆IL-21mRNA、1L-17mRNA含量,并分析二者之间,以及与RORγtmRNA和FEV1的相关关系。分析肺泡壁、气道壁、肺动脉壁Th17细胞与CD8+T细胞的相关性。 结果(1)在肺泡壁中,NS组、S组、COPD组IL-23R+细胞数分别为(46±7)个／cm, (60±15)个／cm, (65±12)个／cm,S组和COPD组与NS组比较,有显著性差异(P0.05或P0.01),COPD组较S组有增高趋势,但无显著性差异(P0.05)。在肺泡壁中,NS组、S组、COPD组CCR6+细胞数分别为(42±6)个／cm, (56±8)个／cm, (62±8)个／cm,S组和COPD组与NS组比较,有显著性差异(P0.05或P0.01),COPD组较S组有增高趋势,但无显著性差异(P0.05)。(2)荧光定量PCR检测结果显示,肺组织匀浆中,NS组、S组、COPD组三组的IL-21mRNA分别为(4.784±2.282),(46.312±15.463),(84.804±21.884),三组间两两比较有显著性差异(均P0.01),COPD组表达增高最明显。NS组、S组、COPD组三组的IL-17mRNA分别为(3.121±1.262),(26.434±7.529),(44.929±15.303),三组间两两比较有显著性差异(P0.01),COPD组表达增高最明显。(3)肺泡壁中,CD4+IL-17+细胞数与IL-17+细胞数、IL-23R+细胞数、CCR6+细胞数有显著正相关(r分别为0.584,0.422,0.670,P0.01或P0.05)。IL-17+细胞数与IL-23R+细胞数无显著性相关(r=0.302,p=0.105)。IL-23R+细胞数与CCR6+细胞数有显著正相关(r=0.572,p=0.001),IL-17+细胞数与CCR6+细胞数有显著正相关(r=0.508,p=0.004)。(4)肺泡壁中CD4+IL-17+细胞数与CD8+T淋巴细胞之间相关系数为(r=0.664,P0.01),气管壁中CD4+IL-17+细胞数与CD8+T淋巴细胞之间相关系数为(r=0.491, P0.05),肺小动脉壁CD4+IL-17+细胞数与CD8+T淋巴细胞之间相关系数为(r=0.518,P0.05)。(5)肺组织匀浆中IL-21mRNA与RORγtmRNA含量呈显著正相关(r=0.757,p=0.000),R0RγtmRNA与IL-17mRNA含量呈显著正相关(r=0.802,p=0.000),IL-21mRNA与IL-17mRNA含量呈显著正相关(r=0.746,p=0.000)。(6)肺组织匀浆中IL-21mRNA、1L-17mRNA与FEV1均呈显著负相关(r分别为-0.694,-0.725,均p=0.000)。 结论肺功能正常吸烟者和COPD患者肺泡壁中IL-17、IL-23R、CCR6表达显著增高并与Th17细胞数呈显著正相关,在肺泡壁、气道、肺动脉中Th17细胞数与CD8+淋巴细胞均有显著正相关,Th17细胞相关因子IL-21、1L-17在肺组织匀浆中RNA转录水平与RORγtmRNA之间均呈显著正相关,与气流受限密切相关。结果提示肺功能正常吸烟者和COPD患者中Th17通过CCR6及IL-23途径趋化浸润到肺实质并增殖活化,分泌工L-17、IL-21等细胞因子,调节中性粒细胞及CD8+T淋巴细胞共同发挥致炎及放大炎症的作用。
【图文】：
銄苑渭膊』颊叻尾恐械谋泶锛耙庖?007级博士学位论文5肺组织匀浆 RORgammatmRNA、蛋白含量测定(表2一2，图2一1，，2)荧光定量PCR结果显示，肺组织匀浆 RORgammat的mRNA表达水平，在NS组为(2.685士0.886)，S组(8.56牡 1.419)，COPD组(10.158土1.574)，三组间两两比较有显著性差异(P<O.01或P<0.05)，以COPD最为显著。 westemblot结果显示肺组织匀浆 RORgammat蛋白表达水平在NS组(0.369士0.094)
(二一0.643， P=0.000)，RORg~at蛋白含量与FEVI占预计值百分比呈显著负相关(二一0.539， P=0.002)。肺组织IL一17蛋白含量与RORg~atRNA含量的呈显著正相关(二0.678， P=0.000)(图2一3，4)。
【学位授予单位】：广西医科大学
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2010
【分类号】：R563.9
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2623033
