PBEF表达变化对肺上皮细胞钠水转运系统的影响研究

发布时间：2020-04-12 01:10

【摘要】：目的:肺泡毛细血管通透性增加和肺泡内液体清除减少是导致体外循环术后急性肺损伤(ALI)形成肺水肿的重要原因。肺泡内液体清除的主要动力是钠水转运系统,我们前期研究发现前B细胞克隆增强因子(PBEF)与体外循环术后肺内皮细胞通透性增加密切相关,而PBEF是否抑制肺上皮细胞钠水转运系统对肺泡内液体的清除还有待进一探讨。因此,本次实验是为了探究PBEF表达变化对肺上皮细胞钠水转运系统的影响。方法:1、运用原代分离RLE-6TN、R3/1细胞。2、运用免疫荧光进行细胞鉴定,鉴定所分离细胞为目的细胞。3、通过pCAGGS PBEF质粒及pCAGGS空质粒转染构建稳定细胞株。4、构建缺氧复氧模型,共分为八组:RLE-6TN细胞对照组、RLE-6TN细胞模型组、RLE-6TN细胞模型-pCAGGS PBEF质粒转染组、RLE-6TN细胞模型-pCAGGS空质粒组。R3/1细胞对照组、R3/1细胞模型组、R3/1细胞模型-pCAGGS PBEF质粒转染组、R3/1细胞模型-pCAGGS空质粒组。5、最后利用ATP酶检测NKA活性,利用PCR和western blot检测PBEF、ENaC、RT140和表面活性物质蛋白(SP)的表达情况。结果:1、荧光定量PCR检测:与对照组相比,转染PBEF质粒后,RLE-6TN、R3/1细胞中PBEF、RTI40两个指标的基因表达量都有所增加,而ENaC和SP表达量下降,结果具有统计学差异(P0.05)。2、Western Blot检测:与对照组相比,转染PBEF质粒后,RLE-6TN、R3/1细胞中PBEF、RTI40两个指标的蛋白表达量都有所增加,而ENaC和SP表达量下降,结果具有统计学差异(P0.05)。3、ATP酶活性检测:与对照组相比,转染PBEF质粒组,RLE-6TN、R3/1细胞中NKA表达下降,结果具有统计学差异(P0.05)。结论:转染PBEF表达质粒后的细胞中,ENaC和肺泡表面活性物质SP表达下降。说明PBEF表达上调后,钠水转运系统主要转运因子的表达受到抑制,肺泡内液体的清除功能也被影响。SP表达的下降表明肺泡上皮细胞的保护作用降低,受到外界刺激时,肺上皮细胞更容易受到损伤。同时,ATP酶活性检测结果证实,与对照组相比,PBEF组的NKA表达含量下降,进一步证明,PBEF的表达上调,影响了肺泡水肿液的清除。
【图文】：

000 maker;1:PUC57-PCAGGS PBEF/BamHI-XbaI;图 1 酶切电泳图疫荧光细胞鉴定图 2 显示，细胞成圆形或椭圆形，细胞特异性标志物 CY。因此可以确定所分离出的细胞即为所需的 RLE-6TN 细胞

A:RLE-6TN 细胞 B:R3/1 细胞图 2 免疫荧光鉴定图3.3 荧光定量 PCR 检测如图 3 所示，与对照组相比，转染 PBEF 质粒后，，RLE-6TN、R3/1 细胞中PBEF、RTI40 两个指标的基因表达量都有所增加，而 ENaC 和 SP 表达量下降，结果具有统计学差异（P<0.05）。说明 PBEF 表达上调后，钠水转运系统主要转运因子的表达受到抑制，肺泡内液体的清除功能也被影响。
【学位授予单位】：南昌大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2018
【分类号】：R563

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本文编号：2624078