桉柠蒎与桉油精对烟熏大鼠气道黏液纤毛清除功能的影响及炎症机制的探讨

发布时间：2020-04-17 02:06

【摘要】：目的:慢性阻塞性肺疾病(COPD),是目前已知的与吸烟明确相关的呼吸系统慢性炎症性疾病。在慢性气道疾病的基础研究中,使用长期被动熏烟方式制备的大鼠模型更接近临床真实世界,逐渐被认可,且有科学研究发表。COPD的病理生理机制包括有气道慢性炎症、黏液高分泌、氧化应激、气道平滑肌收缩和重塑等多个环节,其中黏液纤毛清除(MCC)功能受损被认为是COPD等慢性呼吸系统疾病的主要病理变化。随着对MCC功能研究的深入,黏液调节剂在COPD患者临床应用中的作用被逐渐得到重视,循证学研究证实,在稳定期COPD患者中长期应用黏液调节剂有助于减少急性加重事件的发生。因此,作为黏液调节剂的代表药物,标准桃金娘油(吉诺通)等桉油精相关制剂目前被广泛应用于临床。然而,标准桃金娘油为桉油精、柠檬烯和α蒎烯的复合制剂,目前尚无对比其主要成分桉油精的单一作用与合剂作用的相关研究。而且,有关桉油精制剂的研究多集中于临床,前期临床研究指出其有助于减少气道痰液分泌、减轻炎症水平,但具体作用机制尚不明确。鉴于以上原因,本研究选用目前临床常用的人工合成制剂桉柠派(主要成分为桉油精、α蒎烯及柠檬烯,成分及比例与标准桃金娘油相近)与其主要成分桉油精,比较两种药物在慢性烟熏大鼠模型中的作用,探讨其对气道MCC功能的影响及潜在炎症机制。方法:1、桉柠蒎与桉油精对烟熏大鼠气道MCC功能的研究参考文献通过连续熏烟12周法建立烟熏大鼠模型,并对比加用桉柠蒎及桉油精干预治疗后各组大鼠大体形态、肺HE结构、气道细菌负荷量、接种流感嗜血杆菌(NTHi)后气道对细菌的清除能力、透射电镜下微观结构变化、杯状细胞分泌情况、粘蛋白MUC5AC分泌及表达情况。将大鼠分组为正常对照组、单纯熏烟组、熏烟+桉柠蒎干预组、熏烟+桉油精干预组、熏烟+甘油干预组,其中甘油为桉柠蒎与桉油精的溶剂。2、桉柠蒎与桉油精对烟熏大鼠气道炎症机制的的研究进一步比较两种药物在烟熏大鼠气道中炎症方面的作用,并探讨其机制。对各组大鼠肺泡灌洗液中炎症细胞分类及炎症因子(TNF-α、IL-6、ICAM-1)水平进行比较,,进一步检测p38MAPK及p-p38MAPK蛋白水平,结合MUC5AC表达水平,评价各项指标的相关性,探讨是否桉柠蒎及桉油精对炎症介质的影响与p38MAPK磷酸化有关。采用SPSS16.0统计学软件分析数据,计量资料用均数±标准差描述。两组间比较采用独立样本T检验,多组间比较采用单因素方差分析(方差齐性用LSD及S-N-K检验,方差不齐采用Tamhane’s T2分析),相关性比较采用Pearson相关分析。P0.05有统计学意义,P0.01差异显著。结果:1、桉柠蒎与桉油精对烟熏大鼠气道MCC功能的研究烟熏大鼠表现为一般状态的改变及体重下降,肺功能及病理结构的变化与临床慢性阻塞性肺疾病患者肺功能及病理变化相符,提示模型制备成功。较正常对照组相比,单纯熏烟组模型气道内提示细菌负荷量增加,且对NTHi的清除能力下降;透射电镜显示存在气道上皮纤毛缺失脱落以及细胞结构、细胞器的严重损伤,提示纤毛功能受损,并提示杯状细胞结构发生破坏;AB-PAS染色结果显示,气道上皮杯状细胞分泌粘多糖的成分发生了变化,提示分泌粘液的性质受到影响;免疫组化和PCR结果显示,气道内MUC5AC表达量增多。桉柠蒎干预组大鼠病理结构较单纯熏烟组有一定改善,但与正常对照组相比仍有明显结构改变。与单纯熏烟组大鼠相比,桉柠蒎干预组大鼠气道内细菌负荷量减少,感染后气道内细菌清除加快;透射电镜显示气道上皮纤毛外形结构保存相对完整,提示药物干预对纤毛起一定保护作用,但对损伤的细胞结构和细胞器改善不明显。桉柠蒎与桉油精通过对黏液分泌的影响具有同等作用,均通过调节气道上皮杯状细胞中酸性粘多糖分泌,进而影响黏液性质,同时降低气道MUC5AC表达水平。桉油精与桉柠蒎治疗效果相近,无统计学差异。甘油作为药物对照对各项检测指标无影响。2、桉柠蒎与桉油精对烟熏大鼠气道炎症机制的的研究研究同时发现桉油精相关制剂其有抗炎作用,其炎症指标改善水平与粘蛋白改善水平明显相关。与正常对照模型相比,单纯熏烟组肺泡灌洗液检测发现炎性细胞增多,炎性因子(TNF-α、IL-6与ICAM-1)表达增多,同时伴有p38MAPK及p-p38MAPK蛋白水平增高。加用研究药物干预可减少烟熏大鼠BALF中中性粒细胞比例,减少气道分泌MUC5AC的同时也降低TNF-α、IL-6与ICAM-1水平,p38MAPK和p-p38MAPK表达明显下降,其中p-p38MAPK下降程度更明显,提示可能存在p38MAPK去磷酸化。桉油精与桉柠蒎治疗效果相近,无统计学差异。结论:1、桉柠蒎可减轻烟熏大鼠气道内细菌负荷,通过改善气道黏液纤毛清除功能增加对细菌的清除能力,主要表现在对气道上皮纤毛结构的保护及杯状细胞分泌酸性粘多糖比例、分泌粘蛋白MUC5AC水平的调节。2、在桉柠蒎调节黏液纤毛清除功能的同时存在炎症介质参与,表现为IL-6、TNF-α、ICAM-1等炎症指标下调及磷酸化p38MAPK比例下降,诱导p38MAPK去磷酸化可能是桉柠蒎调节粘蛋白分泌及抗炎作用的共同机制之一,其中桉油精起主要作用。
【图文】：

形态学,熏烟,桉油精,甘油

表 1：各组大鼠肺组织形态学评价组别 MLI（um）平均肺泡数（/nm2）正常对照组 29.09±5.50 325.42±49.45单纯熏烟组 82.47±9.51* 125.48±18.35#桉柠蒎干预组 41.95±6.47**,& 209.74±32.60##,&&桉油精干预组 43.68±6.09 224.86±40.81甘油干预组 77.56±9.77 133.54±22.32如表 1 所示，与正常对照组相比，单纯熏烟组 MLI 明显增加，MAN 明显下降，差异显著（*P，#P<0.01），加用桉柠蒎干预后可明显降低 MLI，增加 MAN（与单纯熏烟组相比&P，&&P<0.01），但较正常对照组相比仍存在明显的结构破坏，即 MLI增加，MAN 下降（**P<0.05, ##P<0.01）。桉油精与桉柠蒎两组间 MLI 与 MAN 指标无明显差异，甘油对照与单纯熏烟组间无明显差异，，形态相近。

各组大鼠肺匀浆
【学位授予单位】：中国医科大学
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2018
【分类号】：R563.9

【参考文献】