TNF-α诱导尘肺纤维化分子机理研究

发布时间：2020-04-22 22:53

【摘要】： 第一部分OM和TNF-α抗体拮抗TNF-α对AM凋亡的研究 目的：探讨OM和TNF-α抗体拮抗TNF-α对AM凋亡的影响。材料和方法：应用支气管肺灌洗方法，收集Wistar大鼠的AM，用Eagels培养液调整细胞浓度为1*10~6/ml，进行纯化培养和刺激培养。实验分4组：空白对照组；加无血清的Eagles液；100μg/ml石英组：加含100μg/ml石英的Eagles液；100μg/ml石英+10ng/ml抗TNF-α抗体组：在用石英刺激前1h加含10ng/ml抗TNF-α抗体的无血清的Eagles液，1h后补加100μg/50μl石英混悬液100μl；100μg/ml石英+800μg/mlOM组：同样在用石英刺激前1h加含800μg/mlOM的无血清Eagles液，1h后补加100μg/50μl石英混悬液100μl。每组设4瓶平行样品。置37℃、5％CO_2恒温培养箱内刺激培养24h。然后，用Elases法检测AM培养上清液中TNF-α的含量；用原位末端脱氧核糖核苷酸转移酶标记技术(TUNEL)，采用荧光标记法检测AM凋亡的水平。结果：TNF-α抗体和OM能明显降低AM培养上清液中TNF-α的含量，经统计学检验，P＜0.05。当TNF-α降低以后，能明显的拮抗TNF-α对AM的凋亡。结论：1．OM能呈剂量依赖方式拮抗SIO_2对AM分泌TNF-α。2．TNF-α能导致AM凋亡，TNF-α抗体和OM能明显的拮抗TNF-α对AM的凋亡作用。实验可能对进一步的认识肺纤维化的发病机理和对肺纤维化的治疗有帮助。 第二部分TNF-α对成纤维细胞增殖的信号转导机制研究 目的：探讨TNF-α致成纤维细胞增殖的信号转导机制，为设计尘肺治疗药物提供分子靶点。材料与方法：应用组织块法原代培养3天大乳鼠肺成纤维细胞，细胞传代至4-5代时用于实验。将4-5代生长良好的细胞分为4组：即5ng/ml、10ng/ml、20ng/ml三个不同剂量的TNF-α细胞因子组，同时设有空白对照组，每组设4瓶平行样品。指标测定：1．免疫组织化学方法检测成纤维细胞膜TNF-αR的表达和PKC的表达；2．应用Western blot方法检测TNF-αRⅠ(P55)和TNF-αRⅡ(P75)的表达；3．应用放射免疫分析方法检测成纤维细胞IP_3、DAG、cAMP和cGMP的水平；4．应用流氏细胞技术检测纤维细胞内Ca离子的含量；5．MTT法测定成纤维细胞的增殖水平。结果：TNF-α能明显的提高TNF-αR阳性表达率，与对照组比较有明显的统计学差异。在TNF-α不同剂量组中，尤以10ng/ml TNF-α作用剂量对成纤维细胞TNF-αR阳性表达率最高，与其它三组比较，有统计学显著性意义。由于TNF-αR有二种，即：TNF-αRⅠ(P55)和TNF-αRⅡ(P75)。在不同的疾病中，TNF-α结合的受体不同，引发的信号转导途径不一样，其发挥的生物学效应也不一样。为此，应用Western blot方法对其二种受体进行测定，进一步确定TNF-α与哪种受体结合而起作用。结果表明：TNF-α主要影响TNF-αRⅡ(P75)的表达，尤其以10ns/mlTNF-α组影响明显。对TNF-αRⅠ(P55)的表达没有影响。TNF-α与TNF-αRⅡ结合后，能使成纤维细胞内IP_3和DAG两信使物质呈剂量和时间依赖性增高。IP_3和DAG是细胞内重要的第二信使。IP_3可以诱发细胞内Ca的释放。在三种浓度的TNF-α剂量组中，10ng/mlTNF-α组对细胞内Ca释放的影响最大，这一结果与TNF-α对膜受体表达的影响水平呈现一致性；与对IP_3的表达水平也基本一致。说明膜受体和IP_3的表达水平可以影响细胞内Ca的释放。DAG和PKC的实验结果显示：PKC的表达水平出奇的与DAG和Ca的表达水平一致。为了进一步证实Ca离子对PKC表达的影响，进行了Ca离子阻断实验，在用10ng/mlTNF-α刺激细胞前1h用Ca离子阻断剂-尼莫地平处理细胞，发现在Ca离子水平明显降低的基础上PKC的表达也较不加Ca离子阻断剂时有所降低。且阻断前后有统计学上的差异。cAMP和cGMP的实验结果显示：不同浓度的TNF-α作用成纤维细胞不同时点时，cAMP和cGMP的水平均有变化，有趣的是5ng/ml和20ng/mlTNF-α组cAMP、cGMP水平随作用时间的延长而增高，但10ng/LmlTNF-α组在作用时间4h时，cAMP的含量明显增高，而作用时间延长到24h时，却趋于下降，而该组cGMP水平的变化却与cAMP相反，cGMP从作用时间4h-24h表现明显的上升，从而导致10ng/ml TNF-α组cAMP/cGMP的比值明显低于其它三组。结合对成纤维细胞增殖效应的实验结果综合分析显示10ng/ml TNF-α能明显提高对细胞的增殖水平，与其它三组比较有明显的统计学差异，P＜0.05。结论：1．TNF-α与成纤维细胞膜TNF-αRⅡ结合，激活G蛋白偶联的PLC、AC激酶，开通IP_3/Ca、DAG/PKC和cAMP/cGMP信号通路是TNF-α致成纤维细胞增殖的机理之一。2．Ca离子和DAG共同促进PKC的表达，IP_3/Ca和DAG/PKC二条途径在信号转导的过程中可能共同协作，引起成纤维细胞的大量增生。3．cAMP/cGMP的比值对成纤维细胞的增殖效应是重要的，当cAMP/cGMP的比值增高时对成纤维细胞的增殖起抑制作用，，反之亦然。4．10ng/ml TNF-α对成纤维细胞的增殖起着关键的作用。 第三部分PGE_2联合TNF-α对成纤维细胞增殖的信号转导机制研究 目的：探讨TNF-α刺激因子与PGE_2抑制因子联合作用时，两种因子的量比例变化对成纤维细胞信号物质的影响。为细胞因子治疗尘肺提供科学依据。材料与方法：应用组织块法原代培养3天大乳鼠肺成纤维细胞，细胞传代到4-5代时用于实验，将4-5代生长良好的细胞分为5组；分为5组：空白对照组；10ng/ml TNF-α；500pg/ml、1000pg/ml、2000pg/ml PGE2组。每组设3个平行样品。指标测定：1．免疫组织化学方法检测成纤维细胞膜TNF-αR的表达和PKC的表达；2．应用放射免疫分析方法检测成纤维细胞IP_3、cAMP和cGMP的水平；3．应用流氏细胞技术检测纤维细胞内Ca离子的含量；4．MTT法测定成纤维细胞的增殖水平。结果：PGE_2可以抑制TNF-α对成纤维细胞膜TNF-αR的表达，且随PGE_2剂量的增加TNF-αR的表达减弱。经统计学检验，P＜0.05。IP_3实验结果表明：当TNF-α联合1000pg/ml和2000pg/ml的PGE_2时，IP_3cpm值随作用时间的增加而增高。尤以1000pg/mlPGE_2组上升明显，特别是从60s-120s时间段表现陡峭上升。与其它四组比较有高度的统计学差异，P＜0.01；10ng/ml TNF-α联合不同剂量的PGE_2在不同时间点对IP_3cpm的变化模式不相同。PGE_2对Ca离子的影响表现为：单独10ng/ml TNF-α作用时，细胞内Ca~(2+)和PKC的表达较空白对照组明显增高(P＜0.05)；当加入不同剂量的PGE_2时，能降低细胞内Ca~(2+)浓度，但与10ng/ml TNF-α组比较没有统计学差异。PGE_2对PKC的表达显示：随着加入PGE_2剂量的增加，PKC水平有所上升，除与对照组比较有差异外，各剂量组之间没有明显的统计学差异。cAMP、cGMP的测定结果显示：TNF-α联合不同剂量的PGE_2与单独10ng/ml TNF-α比较，在观察时点4h时对cAMP表现降低效应，当作用时间延长到24h时，cAMP水平明显升高，对cGMP的作用却是随着作用时间的延长而降低，因此表现cAMP/cGMP比值在作用时点24h时，随PGE_2剂量增加而升高。成纤维细胞增殖试验结果表明：cAMP水平较低而IP_3含量较高的10ng/mlTNF-α联合1000pg/mlPGE_2组对成纤维细胞的增殖作用最强。结论：1．2000pg/m1PGE_2能明显的增加成纤维细胞内cAMP的水平，提高cAMP/cGMP的比值，从而能拮抗10ng/mlTNF-α对成纤维细胞的增殖效应，这一效应与作用时点有关系。2．成纤维细胞增殖与其细胞内cAMP/cGMP比值和IP_3之间的浓度比例有密切关系。3．PGE_2的抑纤维化效应是由cAMP介导的。4．IP_3/Ca和DAG/PKC信号途径表现互为拮抗。 第四部分OM抗石英对AM保护效应的研究 目的：探讨OM抗石英对AM保护效应。材料与方法：应用支气管肺灌洗方法。收集Wistar大鼠的AM，AM浓度为1*10~6/ml，进行纯化培养并按实验设计的要求进行刺激培养。实验分为6组：即，100μg/ml石英组和100μg/ml石英联合200μg/ml、400μg/ml、800μg/ml、1 600μg/ml、3 200μg/ml的OM组，每纽设4瓶平行样品。用小鼠胸腺细胞增殖法和双抗夹心法分别测定AM培养上清液中IL-1、TNF-α细胞因子的含量；2、4二硝基苯肼比色法测定AM内乳酸脱氢酶(LDH)的活力；TBA比色法测定AM内脂质过氧化终产物丙二醛(MDA)的含量：结果：OM能抑制石英诱导AM分泌TNF-α和IL-1。在实验设计的药物剂量范围内，从200～1 600μg/ml，TNF-α的表达水平随药物剂量的增加而下降，存在药物剂量依赖关系，当药物达到3 200μg/ml时，药效减弱；IL-1的表达水平也随药物剂量的增加而降低，尤其是从800～1 600μg/ml时有明显下降。结论：OM具有抗氧化和保护巨噬细胞膜的功能。 第五部分OM抗TNF-α对成纤维细胞增殖机理研究 目的：探讨OM抗TNF-α对成纤维细胞增殖机理。材料与方法：应用组织块法原代培养3天大乳鼠肺成纤维细胞，细胞传代到4-5代时用于实验，按实验设计的要求对成纤维细胞进行刺激培养，实验分为5组：即：空白对照组，10ng/mlTNF-α组，200μg/ml、400μg/ml、800μg/ml不同浓度的OM组。每组3个平行样品。应用免疫组织化学方法测定成纤维细胞膜TNF-αR的表达和PKC的表达；放射免疫分析方法检测成纤维细胞IP_3、cAMP和cGMP的水平；应用流氏细胞技术检测纤维细胞内Ca离子的含量；MTT法测定成纤维细胞的增殖水平。结果：OM能拮抗TNF-α与受体结合，且随OM剂量增加，TNF-αR表达下降；同时使PKC、IP_3和Ca离子的表达结果也随着OM的剂量增加而减弱。cAMP和cGMP的实验结果显示了随OM浓度的升高，cAMP值和cAMP/cGMP比值逐渐升高，当OM浓度为800μg/ml时，cAMP值和cAMP/cGMP比值达到最高；但在不同浓度OM组间，cAMP值无统计学差异，不同剂量的OM组与10ng/mlTNF-α组和对照组间有明显的统计学差异，P＜0.01。cGMP值随着OM浓度的升高而降低。结论：1．OM能拮抗TNF-α对成纤维细胞膜TNF-αR表达，降低细胞内PKC、IP_3和Ca离子水平，提高cAMP/cGMP比值。2．OM抑制成纤维细胞增殖机理是由cAMP介导的。
【图文】：

与对照组比较;*:P<O.05，与石英组比较。2.2粗凋亡检测结果:图1显示:通过TUNEL染色表明，石英作用 AM24h几乎所有的AM全部凋亡，用抗TNF一Q抗体和OM提前1h处理细胞，可明显的抑制石英诱导AM的凋亡。图中的绿色荧光代表细胞凋亡数，红色荧光代表其余全部细胞数。结果见图1空白对照组100p刁ml石英组100林g/ml石英+long/ml抗图1TNF一a抗体 100林g/ml石英+800林 g/mlOMTUNEL法检测AM凋亡图3.讨论尘肺纤维化被认为是继发于炎症过程中的肺组织重建，脂质过氧化、AM膜结构破坏及分泌大量的细胞因子是启动肺纤维化发生前的必然事件。TNF一Q是粉尘导致AM膜结构破坏以后分泌的一种前炎性细胞因子}‘，’。已有大量的资料表明:TNF一。在尘肺纤维化的发生发展中起着重要的作用“3，“’。2003年 PryhuberGs研究发现

即笱Р┦垦绗宦畚乤NF一a诱导尘肺纤维化分子机理研究度呈现先增加后降低的趋势。TNF一a的剂量为10ng/ml时，Ca离子浓度达到最大，但通过多组均数间两两比较，不同TNF一Q剂量组之间没有统计学意义。结果见图7、8和表3。〔翻翻翩暇篇绷城娜翩阶娜属叼鞠翩口口三月目...月通，图7不同剂量TNF一a对成纤维细胞Ca离子的影响，流式细胞测定Ca离子叠加图钡叮定Ca离子样图图8不同剂量TNF一a对成纤维细胞Ca离子的影响从左上依次为空自对照组、sng/ml、long/ml和Zong/ml组。
【学位授予单位】：华中科技大学
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2006
【分类号】：R135.2

【参考文献】

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本文编号：2637057