哮喘人气道平滑肌细胞中蛋白激酶Ca对周期蛋白D1的影响及其对细胞增殖调控的研究

发布时间：2020-05-07 04:52

【摘要】： 哮喘是一种以气道高反应性,气道炎症和气道重建为特征的慢性疾病,目前患病率显著性增高[1],并且被认为是丧失劳动能力、医疗消费和可预防性死亡的主要原因之一[2]。到目前为止许多研究机构已经证实:在慢性哮喘,气道平滑肌在诱导气道重建中起着主要作用[3-6]。气道平滑肌细胞的反常增殖导致了气道重建和气道高反应性,但是其具体的机制目前还不很清楚。 蛋白激酶C(PKC)是一丝氨酸-苏氨酸激酶家族,它包括三种类型的异构体。传统型(α, ?1, ?2,和γ)可被钙、佛波酯和磷脂酰丝氨酸所激活;新型(δ,ε,η,θ, andμ)对钙不敏感,但可被佛波酯和磷脂酰丝氨酸所激活;不典型型(ζandτ/λ)对钙和佛波酯不敏感,但可被磷脂酰丝氨酸激活。人气道平滑肌细胞表达PKCα, ?1, ?2,δ,ε, andζ[7]。不同的异构体的体外激酶活性特征以及组织分布、亚细胞结构是有差别的。这些异构体参与信号通路,调节细胞增殖、分化、凋亡、迁徙和粘附[8-10]。许多研究者已经证明:PKC的激活是ASMCs增殖的必需事件[11-15],并且,不同的PKC异构体在调节细胞增殖中起着不同的作用。在NIH3T3细胞,PKCε是一强有力的生长刺激因素,而PKCα和δ抑制生长[16]。在A7r5血管平滑肌细胞[17],毛细血管内皮细胞[18]和鼠结肠上皮细胞[19],PKCδ也抑制细胞周期进展。在血管平滑肌细胞,PKCδ的过度表达抑制G1期周期蛋白的表达[17],这与PKCδ控制周期蛋白D1的转录的假设一致。在人,牛和鼠气道平滑肌细胞,PKCδ负性调节cyclinD1的转录[20]。我们实验室已经证实:PKCα参与哮喘血清被动致敏的人气道平滑肌细胞增殖[21]。 然而,PKCα调节的下游机制目前还不清楚。细胞周期进展是细胞增殖的的基本事件,目前已经有一些关于ASMCs中调节特殊细胞周期蛋白表达的信号转导通路的研究[22]。cyclinD(D1,D2和D3)是哺乳动物细胞G1期进展的关键调节蛋白,cyclinD1是许多生长刺激信号通路的靶基因[23,24]。 那么,在哮喘人气道平滑肌细胞,cyclinD1是否起关键作用?PKCα是否可通过调节cyclinD1表达来影响ASMC增殖?为此,我们利用哮喘血清被动致敏的细胞模型来研究这些问题。 研究内容 1.用10%哮喘患者血清被动致敏人气道平滑肌细胞(HASMCs)(B组),以10%非哮喘者血清为对照(A组)。构建cyclinD1正、反义真核表达载体质粒并转染干预HASMC。用RT-PCR方法以及Western Blot方法检测cyclinD1的mRNA及蛋白表达水平,用流式细胞术、四甲基偶氮唑盐(MTT)法及增殖细胞核抗原(PCNA)免疫细胞化学技术检测HASMC增殖。 2.生长融合、同步后的HASMCs用哮喘血清致敏后,分为对照组,PMA组和PMA+Go6976组。干预24小时后,用3H-TdR掺入法和MTT法检测细胞增殖;用碘化丙啶单染法流式细胞术分析细胞周期;用RT-PCR和western blotting检测cyclinD1mRNA和蛋白的表达。进一步,我们还通过转染重组的反义cyclinD1质粒(PCDNA3.1(+)/as-cyclinD1)来降低cyclinD1基因的表达后,检测PKCα对HASMCs增殖的影响。 3.用10%哮喘患者血清被动致敏人气道平滑肌细胞(HASMCs),予以PKC激活剂PMA刺激。分别以反义寡核苷酸(PKCα-asODN)和特异性阻断剂U0126抑制PKCα和ERK的表达,用RT-PCR方法及Western Blot方法检测干预前后cyclinD1和P21cip1的mRNA及蛋白表达水平,用流式细胞术和四甲基偶氮唑盐(MTT)法检测HASMCs增殖。 4.用10%哮喘患者血清被动致敏人气道平滑肌细胞(HASMCs),予以PKC激活剂PMA刺激。分别以反义寡核苷酸(PKCα-asODN)和PDTC抑制PKCα表达和NF-κB活化。用凝胶电泳迁移率改变试验(EMSA)检测HASMCs中NF-κB的活性,用RT-PCR方法及Western Blot方法检测干预前后cyclinD1的mRNA及蛋白表达水平,用流式细胞术和四甲基偶氮唑盐(MTT)法检测HASMCs增殖。 结果 1.正常血清对照组细胞S期细胞比例、MTT吸光度值(A值)、PCNA表达阳率分别为(10.52±1.50)%、0.303±0.024和(39.4±8.53)%;哮喘血清组(B0组)细胞S期细胞比例、MTT吸光度值(A值)、PCNA表达阳率分别为(15.94±2.13)%、0.431±0.047和(53.2±7.5)%,均较对照血清组(A组)明显增加(n=5,P0.05);转染重组cyclinD1正义质粒组(B2组)细胞S期细胞比例、MTT吸光度值(A值)、PCNA表达阳性分别为(26.10±2.16)%、0.591±0.042和(84.2±5.9)%,均较哮喘血清组(B0组)明显增加(n=5,P0.05);而转染反义质粒组(B3组)上述结果分别为(6.96±1.25)%、0.220±0.027和(29.8±8.2)%,均较哮喘血清组(B0组)明显下降(n=5,P0.05)。 2. PMA激活PKCα后上调cyclinD1表达和细胞增殖。而用Go6976特异性抑制PKCα活性后,这种促cyclinD1表达和细胞增殖的作用显著性下降。相反, PMA和Go6976对周期蛋白依赖性激酶4(CDK4)的表达无明显影响。另外,转染反义cyclinD1质粒后消除了PMA诱导的G1/S期进展和HASMCs增殖效应。 3. PMA刺激后磷酸化PKCα(p-PKCα)水平增高,ERK1/2,p-ERK1/2蛋白水平增高,cyclin D1、P21cip1表达明显增强, HASMCs的增殖增强;而反义PKCα寡核苷酸转入细胞抑制p-PKCα表达后,ERK1/2,p-ERK1/2表达明显减弱,cyclin D1、P21cip1表达也明显下降,HASMCs的增殖减弱(P0.05,n=4).;用U0126抑制ERK1/2表达后,PMA刺激下p-PKCα水平仍然明显增高,但cyclin D1、P21cip1的表达明显下降,HASMCs的增殖减弱(P0.05,n=4).。 4. PMA刺激后磷酸化PKCα(p-PKCα)水平增高,NF-κB-DNA结合活性增强,cyclin D1表达明显增强, HASMCs的增殖增强;而反义PKCα寡核苷酸转入细胞特异性地抑制PΚCα表达后,p-PKCα水平下降,NF-κB-DNA结合活性明显减弱,cyclin D1也明显下降,HASMCs的增殖减弱(P0.05,n=4);用PDTC抑制NF-κB活性后,PMA刺激下p-PΚCα水平仍然明显增高,但cyclin D1的表达明显下降,HASMCs的增殖减弱(P0.05,n=4)。 结论 1. cyclinD1促进哮喘血清被动致敏的HASMC的增殖。cyclinD1可能是哮喘HASMC增殖的重要调控蛋白。 2. PKCα可通过上调cyclinD1表达而促进哮喘血清被动致敏的人气道平滑肌细胞增殖。 3. ERK1/2是PKCα的下游信号分子,PKCα-ERK1/2级联参与了PMA所诱导的哮喘血清被动致敏的人气道平滑细胞cyclin D1、P21cip1的表达上调及细胞增殖。 4. NF-κB是PKCα的下游信号分子,PΚCα- NF-κB级联参与了PMA所诱导的哮喘血清被动致敏的人气道平滑细胞cyclin D1的表达上调及细胞增殖。 综上所述,上述结果表明:PKCα、cyclinD1参与了哮喘HASMC的增殖调控,并存在PKCα-ERK1/2-cyclinD1、PΚCα-NF-κB-cyclinD1信号转导途径,从不同环节阻断这一信号途径对于针对性地抑制哮喘气道平滑肌增殖、减轻气道重建可能具有积极意义。这为研究哮喘气道重建的发病机理提供新的理论,也为将来治疗难治性哮喘提供一定的新思路。
【图文】：

HASMC呈现“峰和谷”生长状态

HASMCα-actin免疫荧光表达阳性
【学位授予单位】：华中科技大学
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2008
【分类号】：R562.25

【参考文献】

相关期刊论文 前1条

1 许淑云,徐永健,张珍祥,倪望,陈士新;核因子KB在被动致敏的人气道平滑肌细胞增殖中的信号转导作用[J];中华内科杂志;2004年12期

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本文编号：2652465