穿透素3在呼吸机所致肺损伤中作用机制的研究

发布时间：2020-05-08 18:06

【摘要】： 第一部分机械牵张A549细胞对细胞活性和穿透素3表达的影响研究背景与目的大量资料证实了呼吸机所致肺损伤(VILI)与机械牵张应力有关,推测其可能机制是机械牵张对肺细胞的直接刺激触发、激活或启动细胞的牵张敏感基因高表达,其效应蛋白-细胞因子、炎症介质等大量产生,从而引发一系列的生物学反应,造成不同程度的生物学损伤。穿透素-3(PTX3)是一种急性期反应蛋白,也是一种炎症标志物,在炎症级联反应中均起着重要作用,并参与了机械牵张刺激引起的炎症反应过程,且它们基因启动子序列中均含有牵张反应元件,因而我们推测PTX3可能属于牵张敏感基因。本研究拟选择人肺泡Ⅱ型上皮细胞株A549为研究对象,从细胞力学的角度,研究A549在体外周期性机械牵张作用下细胞凋亡和细胞因子分泌的情况,以期为VILI发生机制提供新的理论依据,并为从细胞水平研究VILI提供一个合适模型。同时以该细胞模型为基础在细胞水平观察体外机械牵张对A549细胞PTX3表达的影响。方法本研究采用美国Flexercell公司生产的细胞柔性基底加载装置FX4000T,该系统是通过一个真空泵抽吸特制的柔性细胞培养膜,形成负压而使培养膜拉伸应变,从而使黏附生长在膜上的细胞受到张力的作用,模拟机械通气对肺泡Ⅱ型上皮细胞的力学刺激,细胞所受力的大小正比于培养膜的牵拉幅度即应变率(%),加载程序由FX 4000计算机软件自动控制。对体外培养的A549细胞进行周期性牵张,观察不同机械力和不同牵张时间对细胞的影响。根据不同的处理方式分为静止对照组(C组)和机械牵张组(A组:6%应变率;B组:20%应变率),A组和B组其他加载方案均为:频率0.3Hz,周期性波形为方波,加载时间为1h、2h、4h和6h)。静止对照组:应用“Flexstop”,即一个橡胶塞塞在BioFlex培养板的下面,阻止真空抽吸柔性细胞培养膜。采用Annexin V/PI检测细胞凋亡活性,应用流式细胞仪和激光共聚焦显微镜进行检测,透射电子显微镜检测和Hoechst33258单染法荧光显微镜观察凋亡细胞核的形态变化。同时应用ELISA法检测A549细胞细胞因子TNF-α的分泌。用real-time RT-PCR检测肺泡上皮细胞PTX3 mRNA表达,Western blot检测PTX3蛋白水平。结果与C组相比,牵张1h以上B组A549凋亡和死亡细胞百分比显著增加(p0.01),而A组无显著差异(p0.05),其差异主要是由于早期凋亡和晚期凋亡引起,而死亡细胞百分比没有显著差异(p0.05)。B组呈时间依赖性地引起A549细胞凋亡,同时也促进细胞因子TNF-α分泌。与C组相比,B组细胞PTX3 mRNA表达和蛋白产生呈时间依赖性增加,B组被牵张2h引起PTX3 mRNA和蛋白表达显著增加,分别增加6.25倍和2.58倍(p0.01),而A组细胞PTX3基因的表达没有影响。结论体外过度机械牵张肺泡Ⅱ型上皮细胞A549引起细胞凋亡和细胞因子TNF-α的分泌,并促进了PTX3表达,这可能在细胞力学水平为VILI提供了实验依据,同时也为后面从细胞水平研究VILI的发病机制提供了一个可行的模型。第二部分有效干扰A549细胞穿透素3表达的siRNA的筛选研究背景与目的RNA干扰(RNA interference,RNAi)技术作为特异抑制基因表达的重要手段,已被广泛用于基因表达调控和基因功能的研究及基因治疗。其基本原理是通过是21-23个核苷酸的小片段,即siRNA特异性识别其互补mRNA,促使其降解,使相关基因处于转录后基因沉默,从而使细胞表现出特定基因缺失的表型。目前制备siRNA的方法有体外化学合成、体外转录、体内表达载体合成等,其中体外化学合成具有方便简单的特点。基于上述考虑,本研究旨在筛选有效抑制PTX3表达的体外化学合成的siRNA,从而为进一步探索其功能,并作为某些疾病的治疗手段提供理论依据。方法采用体外化学合成的方法,合成针对PTX3的siRNA各3对、阳性对照、阴性对照和荧光对照FAM-siRNA各1对,用脂质体2000转染A549细胞,用real-time PCR及Western-blot检测PTX3 mRNA和蛋白表达的水平。并转染荧光标记对照FAM-siRNA后,应用流式细胞仪和激光共聚焦显微镜检测转染效率。结果脂质体2000将siRNA转染A549细胞的效率为89.18%±3.26%。与空白对照组相比,3对PTX3 siRNA均有效序列显著抑制了PTX3 mRNA和蛋白的表达(P0.01),其中针对PTX3最有效siRNA能将PTX3 mRNA抑制到3.41%,PTX3蛋白抑制到4.94%。而阴性对照组PTX3 mRNA和蛋白的表达均无显著差别(P0.05)。结论化学合成的siRNA体外应用脂质体2000能高效转染A549,并筛选最有效干扰目的PTX3基因的siRNA,为进一步探索目的基因的功能提供理论依据。第三部分干扰穿透素3表达对机械牵张引起A549细胞活性改变的影响目的研究有效干扰PTX3基因表达对机械牵张引起A549细胞活性改变以及细胞因子释放的影响,探讨其在VILI中的可能作用。方法体外培养于包被胶原基底膜collagenⅠ的BioFlex六孔培养板的人肺泡上皮细胞A549,随机分为空白对照组、静止对照组、牵张组、RNAi组、RNAi+牵张组。空白对照为未给任何干预正常培养细胞;静止对照组应用“Flexstop”阻止牵张;牵张组采用FX4000T细胞应变加载系统周期性牵张细胞,其方案为:应变率为20%,频率为0.3Hz,周期性波形为方波,加载时间为4h; RNAi组应用lipofectamineTM2000分别转染特异靶向PTX3的siRNA;RNAi+牵张组于牵张前12h转染特异靶向PTX3的siRNA。利用real time RT-PCR法检测A549细胞PTX3 mRNA表达的变化;Western blot检测分泌PTX3蛋白;Annexin V流式细胞术检测A549细胞凋亡;ELISA法检测培养基上清中细胞因子TNF-α水平。结果与静止对照组相比,牵张组A549细胞PTX3基因和蛋白的表达显著上调,牵张组PTX3mRNA增加7.397±0.276倍(P0.01),牵张组和静止对照组PTX3蛋白分别为0.647±0.019和1.590±0.060(P0.01)。而与牵张组相比, RNAi+牵张组细胞PTX3 mRNA和蛋白表达显著抑制。与静止对照组相比,牵张组早期凋亡和晚期凋亡细胞百分比显著增加;而与牵张组相比,RNAi+牵张组成活细胞百分比明显增加(85.377%±1.395%和93.727%±0.492%,P0.01),凋亡细胞百分比明显降低。结论周期性机械牵张可通过上调人肺泡上皮细胞PTX3基因和蛋白表达,导致肺泡上皮细胞凋亡增加和过度炎症反应,这一现象可能与VILI的发病机制有关。PTX3作为肺泡上皮细胞上表达的机械牵张敏感基因,从而积极参与了VILI的发病机制。第四部大潮气量机械通气大鼠肺部穿透素3的表达变化研究背景与目的呼吸机所致肺损伤(VILI)是机械通气的严重并发症之一。据统计,有22%～39%进行机械通气病人会发生VILI,死亡率高达15%～30%,严重影响患者预后。大潮气量机械通气时机械牵张应力作为一种炎症前期刺激,能通过特定的信号通路激起炎症级联反应,引起VILI。PTX3是新型的促炎症因子,在炎症级联反应中均起着重要作用,细胞水平研究结果显示,过度机械牵张能显著上调其表达,且基因启动子序列中均含有牵张反应元件,因而我们推测PTX3作为牵张敏感基因,可能在VILI的发病机制中起着重要作用。本实验拟研究大潮气量机械通气对大鼠肺部PTX3表达的影响。方法48只健康成年雄性SD大鼠随机分成正常对照组(C组,n=16,保持正常自主呼吸)、保护性机械通气组(PV组,n=16,潮气量Vt:6ml/kg,PEEP=3～5cm H2O,呼吸频率为70次/分)、大潮气量机械通气组(HV组,n=16,Vt:20ml/kg,PEEP=0),呼吸频率为20次/分。其余通气参数均一致,即吸呼之比为1∶2 ,吸氧浓度FiO2为35%。颈动脉和颈内静脉切开置管,行监测、标本采集和液体及麻醉药的输注。持续检测HR、ECG、有创动脉血压(ABP)、直肠温度量监测。间断进行血气分析,计算氧合指数。机械通气4h后处死大鼠。(1)HE染色光学显微镜下观察各组肺组织病理学变化;(2)检测肺组织湿/干重比值(W/D);(3)检测肺泡灌洗液和血清中蛋白计算肺通透指数(LPI),ELISA法检测肺组织匀浆和肺泡灌洗液中TNF-α;(4)测定肺组织髓过氧化物酶(MPO)活性;(5)TUNEL法检测肺细胞的凋亡;(6)real-time PCR检测大鼠的肺组织中PTX3基因mRNA的表达水平;(7)免疫组化法检测肺组织PTX3蛋白的表达;(8)Western Blot检测肺组织PTX3蛋白的含量。结果(一)PV组与C组相比,肺损伤各项指标无显著改变。HV组通气4h PaO2显著降低(P 0.05),肺组织LPI、W/D和MPO活性均显著增加(P 0.05),组织病理学检测表现急性炎性损伤性改变。HV组大鼠肺组织匀浆和肺泡灌洗液中TNF-α含量显著大于C组和PV组(P 0.01),而C组与PV组无显著差异(P 0.05)。TUNEL法检测可见肺细胞凋亡改变。(二)与C组相比,HV组通气4h后PTX3基因mRNA和蛋白表达均显著升高,PTX3基因mRNA和蛋白分别增加3.493倍和3.799倍;而PV组PTX3基因mRNA和蛋白表达均无显著改变(P0.05)。结论大潮气量机械通气能导致肺损伤,而且显著上调了PTX3基因mRNA和蛋白表达水平,这可能与VILI的发生密切相关。
【图文】：

机械性损伤,生物学

图1. VILI 的可能机制机械性损伤和生物学损伤是相互联系的，机械性损伤可以造成生物学损伤，生物学损伤也可以加重机械性损伤。生物体内众多细胞长期经受着机械力的刺激，比如肺细胞、血管内皮细胞、膀胱平滑肌细胞等等。正常的机械刺激对于细胞的功能维持以及器官的发育是必不可少的，比如正常呼吸时肺细胞受到的伸缩刺激对于胎儿肺细胞的正常分化成熟是必需的，然而过度或不恰当的机械力刺激导致生物学损伤。而机械力究竟是如何转化为细胞乃至生物体的生物学信号一直是国内外研究的热点。研究[5]认为机械牵张刺激可以通过细胞膜整合素受体与胞外基质信号转导、胞膜阳离子通道改变以及较为经典的 MAPK 通路(P38、ERK1/2、JNK、ERK5)等信号通路介导肺损伤的发生。Waters[13]报道牵张刺激可以激活阳离子通道并调节 Na+-K+-ATPase活性,后者在调节细胞内水平衡起重要作用。另有研究证实细胞骨架的连接和构成为机械信号转化为生物学反应提供生理学基础。细胞表面粘合蛋白、整合素、细胞骨架、

淀粉样蛋白,生物学,时机,和血

图 3 VILI 时机械力转化为生物学信号的可能机制PTX3 是一种急性期反应蛋白，与急性期反应蛋白（CRP）和血清淀粉样蛋白（SAP）同属 PTX 家族，，其基因近端启动子区含有 Pu1, AP-1, NF-κB, Sp1 和 NFIL-6 结合位点。PTX3 基因序列分析提示，其启动子中含有牵张反应元件，并有研究已经证实它们参与了机械牵张刺激引起的炎症反应过程，我们推测它们可能属于牵张敏感基因，于上游启动水平参与了 VILI 的发病。PTX3 是一种新发现的由感染和炎症部位组织细胞分泌的炎症标志物，多种组织细胞在炎性刺激下能表达 PTX3 ，包括骨髓源性树突细胞（DC）、内皮细胞，平滑肌细胞、脂肪细胞、成纤维细胞、单核巨噬细胞、树突细胞、滑膜细胞和软骨细胞，还包括上皮细胞，比如肾上皮细胞和肺泡上皮细胞[17]。这暗示着 PTX3 在感染和炎症部位具有放大先天性防御功能[18]。正常人血中 PTX3 水平较低，在炎症和感染情况下迅速
【学位授予单位】：华中科技大学
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2008
【分类号】：R563.8

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