Ang-1基因与辛伐他汀纳米共传递系统对脂多糖诱导急性肺损伤小鼠保护作用研究

发布时间：2020-05-12 23:38

【摘要】：急性肺损伤(acute lung injury,ALI)为肺炎及严重脓毒症等患者常见并发症之一,其恶化阶段即为急性呼吸窘迫综合征(acute respiratory distress syndrome,ARDS),预后差,病死率高,迄今尚无安全有效的早期干预药物,亟待研究进一步解决。肺血管内皮细胞是ALI中最为重要的效应细胞受损靶细胞,也是ALI药物干预的重要靶点。课题组前期构建了肺血管内皮细胞靶向的细胞间粘附分子-1(ICAM-1)单抗辛伐他汀纳米脂质载体(ICAM-NLC),具有一定早期ALI抗炎能力,但总体效果不甚理想,有待进一步提高。为此,本论文通过纳米基因转染技术,以阳离子鱼精蛋白(protamine,Pro)为 DNA 密接材料,血管生成素-1(angiopoietin-1,Ang-1)基因为基因药物,在前期制备ICAM-NLC纳米载体的基础上,通过静电吸附法继续构建ICAM-1单抗辛伐他汀纳米脂质载体/鱼精蛋白/Ang-1基因三元复合物(ICAM-NLC/Pro/Ang),即Ang-1基因与辛伐他汀纳米共传递系统,将Ang-1基因与辛伐他汀共同靶向输送至ALI肺血管内皮细胞,以期通过基因治疗与化学治疗联合用药的方式,进一步提高ALI的早期干预能力。采用静电吸附法构建的ICAM-NLC/Pro/Ang三元复合物,形状呈类球状,粒径随ICAM-NLC质量比例的增高而增大,当ICAM-NLC/Pro/Ang质量比例增加至30:4:1时,三元复合物粒径达到最大约为351.7nm,Zeta电位为12.1mV。凝胶阻滞试验表明,当ICAM-NLC对DNA的比例在10到30之间时,三元复合物中的DNA均可以被完全阻滞,体现了所制备的三元复合物对Ang-1基因的良好保护作用。MTT法细胞毒性试验结果显示,三元复合物与EAhy926细胞共同孵育48h后,细胞存活率高达90%以上,表明三元复合物较低的细胞毒性,是潜在的ALI基因治疗与化学治疗联合用药的纳米载药系统。以脂多糖(lipopolysaccharide,LPS)诱导人血管内皮细胞株EAhy926细胞24h,构建ALI血管内皮细胞模型。研究结果显示,与正常EAhy926细胞相比,经LPS活化后,流式细胞仪所检测到的表达ICAM-1粘附分子的细胞比例从17.2%提高至50.0%,说明成功构建ALI血管内皮细胞模型。用标记了罗丹明(ROX)染料的DNA代替目的基因Ang-1,制备ROX标记的ICAM-NLC/Pro/ROX-DNA三元复合物,考察三元复合物在EAhy926细胞内的转运。细胞摄取研究表明,随着ICAM-NLC比例提高,三元复合物的细胞摄取程度降低,考虑与三元复合物的粒径增大有关;与非ICAM-1单抗修饰三元复合物组相比,经ICAM-1单抗修饰的ICAM-NLC/Pro/ROX-DNA 三元复 合物细 胞转运 能力明 显提升,表明 ICAM-NLC/Pro/ROX-DNA三元复合物对LPS活化后的EAhy926经ICAM-1单抗介导的细胞靶向特性。制备ROX和异硫氰基荧光素(FITC)标记的ICAM-NLC/Pro/DNA三元复合物,考察三元复合物中基因(ROX标记)与NLC(FITC标记)的细胞摄取共定位,结果表明三元复合物与EAhy926细胞孵育6h后,NLC主要分布在细胞质中,而DNA则部分转运到细胞核,说明以NLC为基础的纳米给药系统具有潜在的DNA核导入能力。以ICAM-1单抗阻断细胞表面的ICAM-1粘附分子后,流式细胞仪定量检测显示,摄取ICAM-NLC/Pro/DNA(30:4:1,w/w/w)三元复合物的EAhy926细胞样本MFIs从32降低到了 23,表明经细胞粘附分子(cell adhesion molecule,CAM)介导的内吞机制是三元复合物细胞转运的主要途径之一。采用DiR荧光染料标记ICAM-NLC/Pro/Ang(30:4:1,w/w/w)三元复合物,以LPS诱导构建ALI Balb/c小鼠模型,三元复合物尾静脉注射给药6h后,小鼠体内分布显示肺脏荧光强度最强,证实了 ICAM-NLC/Pro/Ang三元复合物的肺组织靶向特征。以绿色荧光蛋白表达质粒pEGFP为报告基因(EGFP)替代Ang-1基因,制备绿色荧光蛋白标记的ICAM-NLC/Pro/EGFP三元复合物,考察三元复合物在EAhy926模型细胞的基因转染效率;研究结果显示:三元复合物在EAhy926模型细胞内均具有较强的绿色荧光蛋白表达能力(20%以上);随着ICAM-NLC与DNA的重量比从10/1增加到30/1,三元复合物的细胞转染效率呈轻微下降趋势,这可能与NLC比例较高的三元复合物粒径较大,从而更难被细胞摄取有关;与非ICAM-1单抗修饰三元复合物组相比,ICAM-NLC/Pro/EGFP组的基因转染效率显著提高。考虑到辛伐他汀给药剂量及粒径较大纳米粒利于肺组织靶向的需要,选择ICAM-NLC/Pro/Ang(30:4:1,w/w/w)作为后续Ang-1蛋白表达及动物药效学研究。以Western Blot法测定三元复合物在ALI模型细胞及模型动物的Ang-1蛋白表达情况。结果显示:与EAhy926细胞孵育48h后,ICAM-NLC/Pro/Ang组细胞内Ang-1蛋白表达含量显著高于静息细胞组、LPS活化细胞组以及ICAM-NLC细胞组(P0.001);而ICAM-NLC/Pro/Ang组Ang-1蛋白表达又显著高于非ICAM-1单抗修饰三元复合物组(P0.05),可能是基于ICAM-NLC/Pro/Ang对高表达ICAM-1 EAhy926细胞的靶向性。ALI模型小鼠给予ICAM-NLC/Pro/Ang三元复合物48h后,肺组织Ang-1蛋白的表达趋势与EAhy926细胞的表达趋势基本一致。表明ICAM-NLC/Pro/Ang(30:4:1,w/w/w)三元复合物具有提高ALI模型细胞以及模型小鼠中Ang-1蛋白表达水平的作用,具有潜在的改善ALI血管内皮损伤的作用。选择Balb/c小鼠,气管滴注LPS构建ALI小鼠模型,进行三元复合物对ALI小鼠模型保护作用的药效学研究。研究发现,ICAM-NLC/Pro/Ang(30:4:1,w/w/w)给药24h、48h后,与ICAM-NLC组、非ICAM-1单抗修饰三元复合物组相比,具有显著改善小鼠肺泡灌洗液(bronchoalveolar lavage fluid,BALF)中肿瘤坏死因子α(TNF-α)、白细胞介素6(IL-6)等炎症因子水平、炎症细胞总计数以及多形核白细胞(polymorphonuclear leukocytes,PMNs)占BALF中总细胞比例的作用,并且48h的炎症因子水平及炎症细胞水平与24h较为相似;HE染色组织病理切片也提示,ICAM-NLC/Pro/Ang(30:4:1,w/w/w)对ALI模型小鼠病理肺组织的炎症细胞浸润、肺泡隔增厚等病理表征均具有最显著的改善作用。上述结果表明,本研究所构建的ICAM-NLC/Pro/Ang三元复合物,即Ang-1基因与辛伐他汀纳米共传递系统,可有效将Ang-1基因与辛伐他汀共同靶向输送至ALI肺组织,通过基因治疗与化学治疗联合用药的方式,可改善ALI早期的炎症水平,进一步提高了 ALI的早期干预能力,具有潜在的临床应用价值。
【图文】：

１．３结果与讨论逡逑１．３．１邋ＩＣＡＭ－ＮＬＣ／Ｐｒｏ／Ａｎｇ三元复合物的制备逡逑采用静电吸附法制备ＩＣＡＭ－ＮＬＣ／Ｐｒｏ／Ａｎｇ三元复合物。如图１．１所示，带阴离逡逑９逡逑

ｕｓｅｄ邋ａｓ邋ａ邋ｃｏｎｔｒｏｌ．逡逑１＿３．５邋ＩＣＡＭ－ＮＬＣ／Ｐｒｏ／Ａｎｇ三元复合物细胞毒性评价逡逑采用ＭＴＴ法考察三元复合物的细胞毒性，结果见图１．５。ＭＴＴ结果表明，逡逑ＥＡｈｙ９２６邋细胞与邋Ａｎｇ／Ｐｒｏ、ＩｇＧ－ＮＬＣ／Ｐｒｏ／Ａｎｇ、ＩＣＡＭ－ＮＬＣ／Ａｎｇ／Ｐｒｏ邋共同孵育邋４８逡逑ｈ后，不同质量比例的ＩｇＧ－ＮＬＣ／邋Ｐｒｏ／Ａｎｇ及ＩＣＡＭ－ＮＬＣ／Ａｎｇ／Ｐｒｏ三元复合物细胞逡逑存活率均大于９０％；而孵育Ａｎｇ／ＰＥＩ２５Ｋ４８ｈ后，细胞存活率约６０％，细胞存活率逡逑较低，体现本研究中ＩＣＡＭ－ＮＬＣ／Ａｎｇ／Ｐｒｏ三元复合物纳米载体对模型细胞具有较逡逑高的安全性，可作为潜在的ＡＬＩ基因治疗与化学治疗联合的纳米给药系统载体。逡逑１４逡逑
【学位授予单位】：浙江大学
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2019
【分类号】：R563

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本文编号：2661006