骨桥蛋白在内毒素致大鼠急性肺损伤后肺纤维化中的作用研究

发布时间：2020-05-15 06:11

【摘要】：目的：采用腹腔注射脂多糖(lipopolysaccharide,LPS)建立大鼠急性肺损伤(actue lung injury,ALI)后肺纤维化模型,了解肺组织骨桥蛋白(osteopontin,OPN)表达水平以及OPN对脂多糖致大鼠急性肺损伤后肺纤维化肺组织中羟脯氨酸、转化生长因子p1(TGF-β1)、Ⅰ型及Ⅲ型胶原mRNA表达水平的影响,从而探讨OPN在脂多糖致大鼠急性肺损伤后肺纤维化中所处的地位与作用。方法：①将90只清洁级Wistar雄性健康大鼠,平均体重约150-180g,按随机数字表将动物分为正常对照组(NS组,n=30)、模型组(ALI组,n=30)、干预组(n=30)。ALI组：于第0、1、2天腹腔注射LPS (5mg.kg-1.d-1,每1mgLPS溶于1ml的无菌生理盐水中),在LPS注射5分钟后腹腔注射生理盐水(0.5m1)；干预组：第0、1和2天腹腔注射LPS(5mg.kg-1.d-1),LPS注射5分钟后腹腔注射骨桥蛋白抗体(Anti-OPN-Ab)(0.5ml.d-1),效价为1：32)；NS组：第0、1、2天腹腔注射生理盐水(5ml.kg.d-1),第一次腹腔注射生理盐水5分钟后再次腹腔注射生理盐水(0.5ml.d-1)；各组大鼠分别于4小时、8小时、24小时、7天、14天、28天随机处死动物各5只留取标本。②病理组织HE染色及Masson染色进行肺损伤及肺纤维化的评分。③测定羟脯氨酸的含量,具体操作按照试剂盒说明书严格进行操作。④免疫组织化学测定肺组织中TGF-β1的表达。⑤实时荧光定量逆转录-聚合酶链反应(Real-time quantitative reverse transcription-polymerase chainreaction, FQ RT-PCR)检测肺组织Ⅰ型及Ⅲ型胶原mRNA的表达。⑥免疫印迹法(Western blotting)检测各组肺组织匀浆中OPN表达水平,用OPN/p-actin(光密度比值)表示。结果：①NS组大鼠肺组织小叶结构正常,肺泡腔结构清晰,肺间质无炎性侵润,无纤维结缔组织增生,肺泡壁正常。ALI组8小时组可见肺泡壁增厚,肺泡腔内及肺间质可见大量炎性细胞及蓝色胶原纤维增多,7天组可见正常肺泡结构破坏,肺泡腔闭陷、融合,由蓝色胶原纤维及炎性细胞占据形成纤维化,14天及28天炎症较前减轻,肺纤维化程度加重；干预组上述病理表现较ALI组有明显减轻。②ALI组大鼠肺组织羟脯氨酸含量、TGF-β1、Ⅰ型及Ⅲ型胶原mRNA表达呈进行性增加,同一时间点与NS组相差显著(P0.05)；干预组随时间增长表达也为进行性增加,与NS组比较差异有显著意义(P0.05),但与ALI组比较有明显下降(P0.05)。③OPN在大鼠肺组织中的表达：NS组检测到OPN少量的表达,而ALI组和干预组OPN的表达随时间的增加而表达增多,28天表达最明显；进一步经软件灰度分析提示,同一时间点ALI组和干预组间OPN表达无明显差异(P0.05)。结论：①腹腔注射LPS能成功诱导ALI后肺纤维化动物模型,8小时肺损伤最重,28天肺纤维化最明显。②ALI早期即有OPN、羟脯氨酸、TGF-β1、Ⅰ型及Ⅲ型胶原mRNA表达升高,肺纤维化期升高更明显。③OPN促进ALI后肺纤维化大鼠肺组织TGF-β1、羟脯氨酸、Ⅰ型及Ⅲ型胶原mRNA的表达,从而促进ALI后肺纤维化的发生发展。
【图文】：

3.肺组织中TGF一pl的表达水平大鼠肺组织中TGF一田蛋白表达主要位于肺泡巨噬细胞、上皮细胞、内皮细胞及成纤维细胞等细胞质中，呈黄色或棕黄色颗粒(见图27一29)。Ns组

一3.660*109(eone)+42.011，，与对应的GApDH基因两者的M差值均 >0.1，故后续选用双标准曲线法进行定量分析。融解曲线分析结果表明只有一个特异性峰，无引物二聚体及非特异性产物出现(图31)。
【学位授予单位】：泸州医学院
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2011
【分类号】：R563

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本文编号：2664597