肺炎链球菌菌体蛋白LytA和CbpA对感染小鼠的诊断价值

发布时间：2020-05-17 13:50

【摘要】：目的:肺炎链球菌(Streptococcus pneumoniae,S.pn)广泛分布于自然界,为条件致病菌,40%～50%健康人群鼻咽部可携带本菌。当机体处于免疫力低下状态时,引起细菌性肺炎、脑膜炎、中耳炎以及败血症,在婴幼儿和老年感染患者中具有一定的死亡率。据统计在发展中国家,每年约有120万5岁以下的儿童死于肺炎链球菌引起的肺炎。肺炎链球菌感染性疾病的快速诊断实验对早期对症治疗,减少抗生素的滥用,降低发病率和死亡率具有重要的意义。本研究通过基因工程技术获取肺炎链球菌表面蛋白自溶素(LytA)和胆碱结合蛋白(CbpA),探讨其对肺炎链球菌感染小鼠的血清学诊断价值,为进一步应用于临床诊断提供实验基础。 方法: 1.lytA和cbpA基因的原核表达及纯化:根据GenBank中lytA和cbpA基因保守序列设计合成特异性引物,采用PCR技术从肺炎链球菌基因组中扩增lytA和cbpA保守序列片段;经由IPTG诱导并通过等电点洗脱方法获取纯化的重组蛋白LytA和CbpA;Western blot测定表达蛋白的抗体结合活性。 2.建立细菌感染小鼠模型:肺炎链球菌感染实验组及乙型链球菌感染对照组以血清直接凝集效价≥1:160判定为合格待测血清,用于后续ELISA测定。 3.建立ELISA反应模式:以LytA和CbpA为抗原,建立间接ELISA反应模式,测定感染小鼠血清中相应的IgG和IgM抗体,评价诊断价值。 结果: 1.成功构建了原核表达载体pET-32a(+)-lytA和pET-32a(+)-cbpA,表达的重组蛋白LytA和CbpA具有较好的抗体结合活性。 2.成功建立细菌感染小鼠模型,确定感染血清标本来源的可靠性。 3.实验组小鼠(肺炎链球菌感染组)IgM和IgG类抗LytA抗体滴度高于对照组(正常对照组和乙型链球菌感染对照组),差异有统计学意义(P0.05),CbpA抗体与正常对照组差异有统计学意义,与乙型链球菌感染组差异无统计学意义(P0.05)。CbpA蛋白对感染小鼠诊断的敏感性较高(IgG:83.3%;IgM:75%),而LytA特异性较高(IgG:100%;IgM: 100%)。 结论: 1.证实了机体受肺炎链球菌刺激后血清中会出现某些抗体,可以用作血清学诊断。 2.通过基因工程技术获取的重组蛋白LytA和CbpA具有良好的抗体结合活性,可用于血清学反应。 3.以重组蛋白LytA和CbpA为抗原建立的ELISA反应模式可用于检测血清中相应的抗体,协同利用重组蛋白CbpA诊断敏感性及LytA的特异性,对肺炎链球菌感染小鼠的血清学诊断具有一定价值,为进一步用于临床诊断奠定基础。
【图文】：

S.P革兰染色结果(×1000)

菌形态学检查色和奥尔特法荚膜染色结果如图 1-1、1-2 所示。长的球菌，钝端相对；奥尔特法荚膜染色观察到在。图 1-1 S.P 革兰染色结果(×1000)
【学位授予单位】：大连医科大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2011
【分类号】：R563.1

【参考文献】

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1 景巍,王转花;一种快速纯化蛋白的电洗脱方法[J];生物技术;2004年02期

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本文编号：2668655