【摘要】： 背景与目的: 急性肺损伤(ALI)是由严重感染、创伤、休克等因素引起的以炎症反应和肺泡毛细血管膜损伤为主要病理改变,以进行性呼吸困难和顽固性低氧血症为特征的危重症,病情凶险,死亡率高。内毒素是ALI的首要致病因素,肺微血管内皮细胞(PMVEC)及其表达的细胞间黏附分子-1(ICAM-1)在内毒素性ALI病理过程中发挥着关键作用。目前临床治疗尚未取得明显进展,呼吸支持仍是主要治疗手段之一。采用全氟化碳(PFC)液体通气,尤其是雾化吸入治疗ALI较常规机械通气(CMV)有明显优势。然而,其机制尚未完全阐明,特别是PFC的抗炎效应仍有争议,对PMVEC的保护作用及机制有待进一步探讨。为此,本课题拟从器官水平观察PFC雾化吸入对内毒素性ALI大鼠肺微血管通透性的影响,从细胞水平检测PFC作用下脂多糖(LPS)诱导大鼠PMVEC表达ICAM-1的变化,从分子水平探讨PFC对LPS激活大鼠肺微血管内皮细胞Toll样受体4(TLR4)信号转导通路的干预作用,旨在证实PFC的生物学抗炎效应,阐明PFC保护PMVEC的机理,从抗炎角度揭示PFC雾化吸入治疗内毒素性ALI的机制,为临床应用PFC雾化吸入治疗内毒素性ALI提供更坚实的理论基础和实验依据。 方法: 1.采用颈静脉注射LPS的方法复制大鼠内毒素性ALI模型,按随机原则将64只SD大鼠分为正常对照组(N)、脂多糖致伤组(LPS)、常规机械通气治疗组(CMV)和全氟化碳雾化吸入治疗组(PFC)。LPS组大鼠经颈静脉注射6mg/kg LPS致肺损伤;两治疗组大鼠在造模成功后给予常规机械通气,其中PFC组联合应用PFC 10ml/kg/h雾化吸入。通气2h并续观6h后,采集各组大鼠标本,测定动脉血氧分压(PaO2)和肺组织湿干重比(W/D),采用伊文思蓝示踪法检测肺微血管通透性、邻连茴香胺法测定肺组织MPO活性、RT-PCR法和Western Blot法分别检测肺组织ICAM-1 mRNA和蛋白表达水平,并进行肺组织病理形态学观察。 2.采用外周肺组织贴块法培养大鼠PMVEC,抽取组织块进行切片观察,以大鼠肺动脉平滑肌细胞和人脐静脉内皮细胞为对照,对培养细胞进行CD34、植物凝集素BSI、Ⅷ因子相关抗原免疫细胞化学染色鉴定,通过光镜和透射电镜观察细胞形态和超微结构。 3.将对数生长期的大鼠PMVEC接种于Transwell小室透明聚乙烯膜上,在内外室中加入培养液继续培养,融合成致密单层后,随机分为空白对照组(C)、PFC干预组(F)、LPS刺激组(L)、LPS刺激+PFC干预组(LF)。以处理0h为空白对照组,F组在Transwell外室中加入PFC进行干预,L组在Transwell内室中给予100ng/ml LPS刺激细胞,LF组在Transwell内室和外室中分别施加100ng/ml LPS和PFC进行共孵育。各处理组细胞孵育3、8、24h后,通过光镜和MTT法分别观测F组细胞形态和活力,采用RT-PCR法和流式细胞术(FCM)分别检测各组细胞ICAM-1 mRNA和蛋白表达水平。 4.将大鼠PMVEC培养于Transwell小室,融合成致密单层后,按上述方法分组和处理细胞,24h后采用FCM检测C组、F组细胞TLR4蛋白表达水平及FITC-LPS结合量,应用Western Blot和EMSA法分别测定C组、L组、LF组细胞TRAF6、磷酸化p38MAPK蛋白表达量和NF-κB活化水平。 结果: 1.与正常对照组比较,LPS致伤组大鼠的PaO2下降、W/D比值增大、肺微血管通透性增强、肺组织MPO活性增高,肺组织ICAM-1 mRNA和蛋白表达水平上调,肺组织病理形态学积分增加(P㩳0.01);CMV治疗组大鼠的上述指标与LPS致伤组比较无显著性差异(P㧐0.05);PFC雾化吸入治疗组则较LPS致伤组和CMV治疗组均有显著改善(P㩳0.01-0.05)。 2.组织块法培养大鼠PMVEC的综合鉴定结果显示:组织块源于外周肺组织,CD34免疫细胞化学染色阳性,植物凝集素BSI结合试验阳性,而Ⅷ因子相关抗原染色阴性,透射电镜未见Weibel-Palade小体。 3.正常大鼠PMVEC经PFC干预3、8、24h后,细胞形态、细胞活力、ICAM-1 mRNA和蛋白表达水平与C组比较无显著性差异(P㧐0.05);L组给予LPS刺激3、8、24h后,各时相点细胞的ICAM-1 mRNA和蛋白表达量均较C组显著增高(P㩳0.01-0.05);LF组细胞经LPS刺激和PFC干预后,与L组同时相点比较,3h组ICAM-1 mRNA和蛋白表达水平无明显差异(P㧐0.05),但8h组和24h组均有显著降低(P㩳0.01-0.05)。 4.流式细胞术检测结果发现,F组细胞TLR4蛋白表达水平及FITC-LPS结合量与C组比较无显著性差异(P㧐0.05);Western Blot和EMSA测定结果显示,L组细胞TRAF6的蛋白表达量、p38MAPK的磷酸化水平及NF-κB的结合活性均较C组显著增高(P㩳0.01-0.05);与L组比较,LF组细胞TRAF6蛋白表达量无显著性差异(P㧐0.05),但p38MAPK的磷酸化水平和NF-κB的结合活性均有显著降低(P㩳0.05)。 结论: 1.全氟化碳雾化吸入对LPS诱导的大鼠ALI具有保护作用,可明显减轻肺部炎症反应、改善肺微血管通透性,下调肺组织ICAM-1表达、抑制PMN肺内聚集是其保护机制之一。 2.外周肺组织贴块法是一种简便、经济、有效的大鼠PMVEC体外培养方法,Ⅷ因子相关抗原和Weibel-Palade小体并非鉴定大鼠PMVEC的理想指标,联合应用外周肺组织切片、CD34和植物凝集素BSI三指标为组织块法培养的大鼠PMVEC提供了一个简单易行、合理、可靠的综合鉴定方案。 3.全氟化碳不影响正常大鼠PMVEC的细胞形态和细胞活力,可通过生物学抗炎效应下调LPS诱导的肺微血管内皮细胞ICAM-1表达,进而保护PMVEC。 4.全氟化碳作用于LPS刺激的大鼠PMVEC后,既未影响细胞外LPS与TLR4的亲和,也不阻断TRAF6上游的TLR4细胞内信号转导通路,而是通过抑制TRAF6下游NF-κB和p38MAPK的活化而干预LPS诱导PMVEC表达ICAM-1。
【图文】：
TT 溶液： MTT，放入小烧杯中，加 50ml 0.01M PBS，搅拌溶解菌，分装，，4℃冰箱避光保存。法微血管内皮细胞的分离、培养和鉴定组与处理鼠 PMVEC 接种于 96 孔 Transwell 小室透明聚乙烯膜培养，融合成致密单层后，采用随机数字表法把 20 、8、24h 组。各处理组细胞在 Transwell 内室中加入培行共孵育，同时设置与试验孔平行而不加细胞只加培细胞干预相应的时间后进行指标观测。Transwell 小室
进行多组比较，组间两两比较采用 q 检验。P㩳0.05 统差异非常显著。结 果正常大鼠 PMVEC 细胞形态的影响微镜下观察大鼠 PMVEC，PFC 处理 3、8、24h 组与 短梭形或多角形，细胞核清晰，细胞质丰富，大小均长，细胞间仍保持紧密连接，见照片 2-9。正常大鼠 PMVEC 细胞活力的影响PMVEC 经 PFC 处理 3、8、24h 后，MTT 法测得各组）、（0.919±0.035）、（0.911±0.012），与 0h 组（0.923（P㧐0.05），各组吸光度值变化见图 2-2。
【学位授予单位】：第三军医大学
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2007
【分类号】：R563
【共引文献】
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2672763
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