SP-D基因缺陷小鼠肺部病理和免疫改变及外泌体干预对肺修复作用的研究

发布时间：2020-05-22 09:29

【摘要】：研究背景临床危重症患者因病情重、病种多和免疫力低导致患者合并感染的发生率很高,又因卧床、有创机械通气等原因使得危重患者发生肺部感染的情况最为多见。通常对于危重患者较之普通患者的抗感染策略更全面、更强化也更为复杂,抗菌药物的选择及停用对于临床医生经常是比较棘手的问题,抗感染治疗后肺部感染的再发也是一大难题。论文前期对肺部感染再发的危险因素开展了临床研究,所获结果不仅对于医生做出更合理的抗感染临床决策有指导意义,还启发了从患者宿主防御角度开展危重肺病基础实验研究的思路。肺表面活性物质是由肺泡Ⅱ型上皮细胞分泌的磷脂-蛋白混合物,肺表面活性蛋白(SP)是肺表面活性物质的重要组分,其中SP-D不仅对于降低肺泡表面张力有重要作用,SP-D同时也是宿主防卫蛋白,在肺的天然免疫中发挥重要作用。论文从SP-D基因缺陷小鼠动物模型入手,研究肺的病理状态和免疫改变,并对SP-D基因缺陷小鼠进行间充质干细胞来源的外泌体干预,探索能否为危重肺病提供肺修复的可能。研究目的1、通过SP-D基因缺陷小鼠模型,对肺组织病理学、肺内炎症小体、血清炎症因子和肺泡巨噬细胞等进行实验研究。2、探索能否应用间充质干细胞来源的外泌体来修复因SP-D基因缺陷所致的肺部病理及免疫改变。研究方法1、选择相同遗传背景(C57BL/6)的WT小鼠与SP-D KO小鼠为动物模型基础,将生长到6个月龄以上的SP-D KO小鼠作为主要研究对象。2、准备间充质干细胞来源的外泌体用以治疗动物模型,首先对间充质干细胞进行细胞培养及传代筛选,然后采用试剂盒法从间充质干细胞提取外泌体,并对提取的外泌体进行蛋白定量及透射电镜检测。3、应用间充质干细胞的外泌体干预SP-D KO小鼠,采用经鼻给药途径对小鼠进行不同剂量疗程的外泌体治疗,对经外泌体治疗的小鼠和未经治疗的小鼠进行分组,并根据研究需要对经过治疗的小鼠进一步分为不同治疗剂量的亚组。4、对各组小鼠分别给予留取下腔静脉血,进行肺泡灌洗或留取肺组织。5、对小鼠肺组织进行HE染色研究肺的组织病理学,比较经外泌体治疗的和未经治疗的小鼠肺的组织病理学改变。6、通过免疫荧光试验检测不同组别小鼠肺内NLRP3炎症小体的活化情况,同样的免疫荧光法检测不同组别小鼠肺内p-NF-κB p65的表达情况。7、ELISA法检测不同组别小鼠血清中炎症因子IL-6和IL-1β的表达情况。8、对肺泡灌洗液进行炎症细胞学研究,并尝试对肺泡巨噬细胞进行体外的吞噬实验。9、应用SigmaStat软件进行统计学分析,各组数据应用均数±标准差表示,组间比较应用t检验或ANOVA,P0.05为差异有统计学意义。研究结果1、小鼠的肺组织经过HE染色后,WT小鼠显示正常肺组织表现,6个月龄以上的SP-D KO小鼠显示出重度的肺气肿表现,外泌体治疗后的SP-D KO小鼠为轻度肺气肿表现。经过测量肺泡直径并进行统计,与未治疗组小鼠相比较,治疗组小鼠的单个独立肺泡直径较小,差异有统计学意义(P0.05)。2、免疫荧光法检测肺内NLRP3炎症小体的结果显示,与WT小鼠相比SP-D KO小鼠肺内NLRP3的表达上调,然后将不同外泌体剂量的治疗亚组分别与未治疗组进行比较,发现随着治疗剂量增加到3个剂量和4个剂量,NLRP3的表达有下调趋势(P0.05)。3、免疫荧光法检测肺内p-NF-κB p65的表达情况,结果显示与WT小鼠相比SP-D KO小鼠肺内p-NF-KB p65的表达上调,然后将不同外泌体剂量的治疗亚组分别与未治疗组进行比较,发现随着治疗剂量增加到3个剂量和4个剂量,p-NF-κB p65的表达有明显的下调趋势(P0.01)。4、ELISA法检测各组小鼠血清IL-6和IL-1β的结果显示,WT组、SP-D KO治疗组和SP-D KO未治疗组的炎症因子表达量都处在较低水平。5、肺泡灌洗液炎症细胞学研究发现,经过外泌体治疗和未经过治疗的SP-D KO小鼠肺泡灌洗液中均以巨噬细胞和淋巴细胞为主,对每种炎症细胞的构成比进行组间比较,未见显著差异。肺泡巨噬细胞的吞噬实验可见巨噬细胞吞噬细菌现象。研究结论1、6个月龄以上的SP-D KO小鼠肺组织出现重度肺气肿表现,表明SP-D具有对肺泡的维持稳态作用。2、SP-D KO小鼠肺内NLRP3炎症小体和p-NF-κB p65均表达上调,表明SP-D对肺NLRP3炎症小体和NF-κB信号通路的激活有抑制作用。3、经MSC外泌体治疗的SP-D KO小鼠肺组织为轻度肺气肿表现,表明MSC外泌体可在一定程度上修复SP-D基因缺陷小鼠的重度肺气肿病理状态。4、增加MSC外泌体治疗剂量,可以抑制SP-D KO小鼠肺NLRP3炎症小体和NF-κB信号通路的激活。表明MSC外泌体干预可对SP-D基因缺陷小鼠肺的免疫改变起到某种程度的修复作用。
【学位授予单位】：山东大学
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2019
【分类号】：R563

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本文编号：2675786