硫氧还蛋白在高氧肺损伤中的作用

发布时间：2020-06-05 00:17

【摘要】： 第一部分高氧对硫氧还蛋白系统表达的影响【目的】建立早产新生大鼠高氧暴露肺损伤动物模型,观察高浓度氧对早产鼠肺组织形态学影响以及硫氧还蛋白系统表达水平的变化,探讨硫氧还蛋白系统在高氧肺损伤中的可能作用。【方法】孕21天SD大鼠行剖腹产术,娩出的新生鼠为早产鼠。早产SD大鼠生后d1随机分为两组：空气组和高氧组。高氧组持续暴露于氧浓度85%的氧箱内,空气组置于常压空气中。两组分别于空气或高氧暴露后1、4、7、14d,10%乌拉坦腹腔注射麻醉,提取肺组织总RNA和总蛋白,采取半定量逆转录聚合酶链反应(reverse transcription polymerase chain reaction, RT-PCR)检测硫氧还蛋白和硫氧还蛋白还原酶mRNA表达水平；免疫组织化学方法检测硫氧还蛋白在肺组织中的分布和表达强度；免疫印迹法检测肺组织硫氧还蛋白蛋白水平的动态变化；同时采用HE染色观察肺组织形态学改变,并进行辐射状肺泡计数。【结果】①肺组织形态学观察：空气对照组呈正常肺发育状态,高氧组肺组织可见明显肺泡炎性改变和肺发育滞后,同时伴有辐射状肺泡计数的显著减少(p0.05)。②与空气对照组比较,高氧暴露诱导了Trx、TrxR mRNA水平的显著上调,同时Trx蛋白水平也呈现相应的升高(p0.05)③免疫组织化学染色结果显示,Trx普遍分布于肺组织血管内皮细胞和肺泡上皮细胞胞浆内,高氧暴露组Trx强度较对照组增强。【结论】高氧暴露诱导肺组织广泛的炎症反应及肺发育落后,同时上调肺组织Trx、TrxR表达水平。Trx系统表达增高可能在早产鼠高氧肺损伤的发病机制中发挥重要保护作用。第二部分硫氧还蛋白对高氧暴露胎鼠肺泡上皮细胞的保护作用【目的】观察补充外源性硫氧还蛋白对高氧诱导的胎鼠肺泡Ⅱ型上皮细胞损伤的影响,探讨硫氧还蛋白可能的作用机制。【方法】无菌分离、培养胎鼠肺泡Ⅱ型上皮细胞。随机将细胞分为单纯高氧暴露组和重组人硫氧还蛋白(recombinant human thioredoxin,rhTrx)处理组,两组同时暴露于氧浓度95%的高氧环境。两组分别于高氧暴露0、12、24、48h,MTT法检测细胞活力情况；流式细胞术检测细胞凋亡和细胞内活性氧(reactive oxygen species,ROS)的生成；超氧化物歧化酶、过氧化氢酶、谷胱甘肽过氧化物酶活性分别由其相应的酶活性检测试剂盒进行测定；免疫印迹蛋白检测法测定丝裂原激活蛋白激酶(mitogen-activited protein kinase,MAPK)和磷脂酰肌醇(3)激酶-蛋白激酶(phosphoinositide 3-kinase/protein kinase B,PI3K/Akt)信号通路活性。【结果】与单纯高氧暴露组细胞比较,①rhTrx处理显著减轻了高氧诱导的肺泡上皮细胞的死亡,提高了细胞活力；②rhTrx显著降低了细胞ROS的水平；③rhTrx显著提高了锰型超氧化物歧化酶和谷胱甘肽过氧化物酶的活性；④rhTrx激活了细胞外信号调节激酶1／2(extracellular signal regulated kinase,ERK 1/2)ERK 1/2和P13K活性,而抑制了c-Jun N末端激酶1/2(c-Jun N-terminal protein kinase,JNK1/2)和P38丝裂原活化蛋白激酶(P38mitogen-activited protein kinase,p38)的活性. 【结论】硫氧还蛋白通过减少细胞内ROS的生成、提高抗氧化酶活性、调控MAPKs和PI3K-Akt信号通路对高氧暴露胎肺泡上皮细胞发挥保护作用。第三部分硫氧还蛋白在高氧暴露早产鼠肺损伤中作用的相关机制研究【目的】建立早产新生鼠高氧暴露肺损伤动物模型,观察外源性Trx对高氧暴露早产鼠肺损伤的作用,并探讨Trx的可能作用机制,为高氧肺损伤的防治寻找新的靶点。【方法】孕21天SD大鼠行剖腹产术,娩出的新生鼠为早产鼠。早产鼠生后dl随机分为3组：①空气对照组,简称空气组；②单纯高氧暴露组,简称高氧组；③Trx干预+高氧暴露组,简称Trx干预组。空气对照组置于室温空气中；单纯高氧暴露组和Trx干预组置于密闭氧箱中,氧浓度维持85%,由数字测氧仪连续监测。Trx干预组每日腹腔注射rhTrx (2mg/kg),空气组和单纯高氧暴露组注射与rhTrx同体积的PBS。每日观察早产鼠生长状态、定时监测体重、记录死亡情况。于空气或高氧暴露后14d,取肺组织标本分别称量肺湿和干重并计算湿干比；石蜡切片行HE染色观察肺组织的病理学变化并进行辐射状肺泡计数(radical alveolar counts,RAC)；荧光实时定量PCR (real-time PCR)技术检测肺组织血管内皮生长因子(vascular endothelial growth factor, VEGF)、血管内皮生长因子受体(vascular endothelial growth factor receptor, VEGFR)和Toll样受体(Toll like receptor, TLR) 2、4 mRNA表达变化；免疫印迹蛋白检测技术观察MAPKs、PI3K-Akt信号通路活化情况及caspase 3蛋白水平。【结果】①空气对照组未出现早产鼠死亡；高氧暴露早产鼠死亡率较高达28.6%,存活者出现明显生活能力下降和体重增长迟缓；与单纯高氧暴露组比较,rhTrx处理显著提高了早产鼠生存率,死亡率降低到11.1%,生活能力下降和体重增长迟缓情况亦明显改善；②高氧暴露能引起早产鼠肺组织明显炎症反应和肺发育受阻,同时伴有RAC值下降,而应用rhTrx能显著减轻高氧导致的肺损伤形态学改变；③与单纯高氧组比较,rhTrx显著减轻了高氧诱导的早产鼠肺组织水肿；④荧光定量PCR结果：与空气对照组比较,高氧暴露显著抑制早产鼠肺组织VEGF、VEGR mRNA表达,而对TLR4 mRNA具有上调作用,对TLR2无显著影响；rhTrx处理显著提高高氧暴露后肺组织VEGF、VEGR及TLR4基因水平的表达；⑤与单纯高氧暴露组比较,Trx处理组早产鼠肺组织细胞外信号调节激酶1／2(extracellular signal regulated kinase, ERK1/2)和Akt活性显著增高,c-JunN末端激酶1/2 (c-Jun N-terminal protein kinase, JNK1/2)、P38丝裂原活化蛋白激酶(P38mitogen-activited protein kinase, p38)及caspase 3勺活性明显下降(p0.05) [结论]硫氧还蛋白在早产鼠高氧肺损伤中具有保护作用；通过诱导VEGF及其受体、TLR4基因水平高表达,调控MAPKs和PI3K-Akt信号通路是其发挥保护作用的具体机制。
【图文】：

硫氧还蛋白在高氧肺损伤中的作用

ASCII正常培养24h

高氧,细胞活力

正常培养AECn外形呈圆形或立方形，岛状生长，细胞贴壁好，胞体饱满;高氧暴露24h后，，细胞贴壁欠佳，颜色变暗，细胞内可见颗粒，表现为生长不良状态，部分细胞死亡。见图2一1、2一。图2一 1AEcH正常培养24h!!!鑫鑫霎霎麟鬃鬃霎霎霎霎镌…纂纂毓毓毓翼爵爵嗡嗡赫赫赫惑妾妾聋翩翩臀臀臀 iii图2一 2AECI工高氧培养24h 2)MTT检测高氧对AECn细胞活力的影响与正常培养细胞比较，随着高氧暴露时间的延长，高氧培养细胞MTT值逐渐下降，细胞活力呈时间依赖性。见图2一3。54
【学位授予单位】：华中科技大学
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2010
【分类号】：R563

【参考文献】