基于Nrf2通路探讨黄芪甲苷对MRC-5抗氧化机制的研究及临床应用探讨

发布时间：2020-06-07 10:35

【摘要】：目的:肺纤维化(PF)是一种多个病因引起的发病机制不完全明确的肺系疾病。现已证实,氧化应激诱导的细胞氧化/抗氧化失衡是促使肺纤维化形成及进展的关键,Nrf2/ARE通路是重要的内源性抗氧化信号通路。前期研究发现益气类中药对肺纤维化的氧化应激损伤有显著的保护作用,同时导师张伟临床诊疗中发现,抗纤维化组方中配伍黄芪等益气类中药(加减补肺汤、防己黄芪汤、补膏等)能明显改善肺纤维化患者的预后,临床疗效显著。本实验基于Nrf2信号通路探究黄芪甲苷对人胚肺成纤维细胞MRC-5的抗氧化干预作用,通过观察该通路相关基因及下游蛋白的表达情况,从而明确其抗氧化应激的机制,为临床治疗肺纤维化提供有效的理论支持。方法:首先MRC-5细胞氧化应激模型的构建及黄芪甲苷最佳作用浓度选择。其次实验分组:空白组、H2O2造模组、黄芪甲苷组、H2O2造模后给予黄芪甲苷组、黄芪甲苷干预后给予H2O2组,以6、12、24h为时间监测点,检测SOD、CAT、MDA、GSH表达,RT-PCR检测各组Nrf2、keap1、NQO1、HO-1mRNA的表达并比较,选取最佳时间点免疫荧光化学法观察Nrf2的分布,并对以上数值进行比较、分析。结果:1.当H2O2浓度600μmol/L孵育24h时,使细胞抑制率达到33.96%,该刺激浓度、作用时间以及对于细胞的损伤抑制程度符合最佳造模需求,故以600umol/L作为造模浓度进行后续试验。2.当黄芪甲苷的药物浓度达0.3125mg/ml时,使细胞抑制率达到11.04%,该药物剂量下,细胞抑制率较低,对MRC-5细胞损伤小,药物浓度相对安全,将该浓度定为该实验的药物最大无毒浓度。3.黄芪甲苷能明显提高MRC-5细胞内各抗氧化指标SOD、CAT、GSH表达量,同时能显著降低提示机体氧化损伤的指标MDA表达水平,均有时间依赖性,统计学意义显著(P0.05)。4.黄芪甲苷能明显提高MRC-5细胞内各抗氧化蛋白HO-1、NQO1、Nrf2表达水平,降低Keap1的表达量,具有明显的统计学意义(P0.05)。5.黄芪甲苷能够明显提高细胞核内Nrf2表达水平,并可以促进Nrf2表达由胞质内向胞核内转移,提高机体的抗氧化能力。结论:黄芪甲苷能够上调MRC-5细胞Nrf2的表达,增强Nrf2的转录激活进而上调肺部抗氧化酶和相关解毒酶类基因的表达以发挥保护作用,猜测黄芪甲苷可能是通过干预Nrf2/ARE信号转导通路来发挥抗纤维化作用,并且有一定的预保护作用。临床上抗纤维化组方中配伍黄芪等益气类中药,可能是从抗氧化应激方面对肺纤维化起到治疗效果。
【图文】：

细胞损伤,作用时间,刺激浓度,氧化损伤

4 实验结果及分析4.1 CCK-8 法检测 H2O2 诱导的 MRC-5 细胞增殖抑制情况由图（1）可见，不同浓度的过氧化氢对人胚肺成纤维细胞细胞均有一定损伤作用，细胞增殖的抑制程度随 H2O2 浓度升高而增强，随时间 6h 开始延至 24h，并且由图可以看出抑制程度呈递增趋势，当 H2O2 浓度 600μmol/L 孵24h 时，使细胞抑制率达到 33.96%，该刺激浓度、作用时间以及对于细胞的损抑制程度符合最佳造模需求，故可以考虑以 600umol/L H2O2 预刺激 24 小时诱的 MRC-5 氧化损伤模型进行后续试验。

黄芪甲苷

图 2 不同浓度黄芪甲苷对 MRC-5 细胞抑制的影响3 细胞生化检测各组 MRC-5 人胚肺成纤维细胞中 SOD、CAT 活力和 M表达图 3 可见，与空白组与黄芪甲苷组比较，H2O2组、黄芪甲苷+H2O2组甲苷 MDA 水平增加，SOD、CAT、GSH 水平降低；H2O2组比较，黄芪甲、H2O2黄芪甲苷组 MDA 水平降低，SOD、CAT、GSH 明显增加，组间比较 P 均异性显著。黄芪甲苷+H2O2 组与 H2O2+黄芪甲苷组相比，黄芪甲苷干预予 H2O2 刺激组，细胞内的抗氧化指标明显高于 H2O2 干预 1h 后给予，同时氧化损伤指标前者低于后者，，两者比较 P 均<0.05,具有统计学出黄芪甲苷优越的预保护作用。图 3 各组细胞内 MDA、SOD、GSH 和 CAT 水平比较（ ±s）别MDA（nmol/mg） SOD（U/mg） GSH（nmol/mg）白组 18.02±1.10 16.03±2.00 10.05±0.05 x
【学位授予单位】：山东中医药大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2018
【分类号】：R563

【参考文献】