【摘要】：目的:特发性肺纤维化(idiopathic pulmonary fibrosis,IPF)是一种常见的慢性、进行性和致死性的肺部疾病,其特征是纤维母细胞和成纤维细胞的异常增生和重构。IPF的病因尚不明确,目前被广泛接受的观点是,特发性肺纤维化是由于受损的肺泡上皮细胞异常激活,引起成纤维细胞增生、纤维母细胞募集和上皮-间质转化,进而导致细胞外基质的沉积,损伤修复异常和肺部结构重构。针对IPF现阶段尚无有效的治疗手段,因此阐明其发生、发展过程对于IPF的预防和治疗具有重要意义。上皮-间质转化(epithelial-mesenchymal transition,EMT),是指上皮细胞失去其表型转而获得间质细胞表型的过程。该过程中伴随着细胞极性的消失、胞间连接的解聚和细胞骨架的重排。在正常生理状态下,EMT参与胚胎发生、器官发育、创伤修复和组织重构等一系列重要的生命进程。在病理条件下,EMT也可以被异常激活,增强细胞的增殖和转移能力,这点在癌症的发生和发展过程中尤为显著。近期研究表明,IPF疾病进程中EMT扮演着重要的角色,受损肺泡上皮细胞EMT可能是间质细胞的起源之一。内体分拣转运复合体(endosomal sorting complex required for transport,ESCRT)是一种能够识别并分拣泛素化蛋白的多亚基复合体。其成员包括:ESCRT-0、ESCRT-Ⅰ、ESCRT-Ⅱ、ESCRT-Ⅲ和Vps4-Vtal辅助因子家族,广泛参与胞质分裂、病毒出芽、自体内吞、细胞自噬、胞膜损伤修复以及胞内信号转导等诸多细胞进程。CHMP3属于ESCRT-Ⅲ家族成员,与其它三个核心亚基(Vps20、Snf7和Vps2)以及三个调节亚基(Did2、Vps60和Ist1)共同组成ESCRT-Ⅲ亚复合体,在多泡体(multivesicular body,MVB)生物合成中共同发挥作用。研究表明,ESCRT系统参与调控受体信号通路,维持上皮细胞极性,抑制肿瘤细胞转移。这些现象与细胞EMT进程息息相关,我们大胆推测ESCRT系统可能在肺泡上皮细胞EMT进程中扮演某种角色,并设计实验进行验证。本课题使用TGF-β诱导人肺腺癌细胞系A549细胞的方法,构建了肺泡上皮细胞EMT模型,检测了E-cadherin、Vimentin和α-SMA在诱导前后表达量的变化,以及肺泡上皮细胞EMT进程中ESCRT系统成员CHMP3的表达趋势。分别采用多泡体生成抑制剂U18666A和构建过表达CHMP3 A549稳转细胞系的方法,初步探究了CHMP3对A549细胞EMT进程的影响及其潜在的分子机制。研究方法:1、本研究使用TGF-β诱导A549细胞构建肺泡上皮细胞EMT模型。分别应用倒置显微镜观察诱导前后细胞形态变化;Western Blot技术检测诱导前后相关上皮分子标志物E-cadherin和间质标志物Vimentin表达量的变化;免疫细胞荧光染色检测诱导前后E-cadherin、Vimentin和α-SMA表达量的变化,评估造模效率。应用Western Blot技术检测诱导前后CHMP3表达量的变化,观察ESCRT系统在细胞EMT过程中的应答。2、我们构建了过表达CHMP3的A549稳转细胞系,使用TGF-β分别诱导A549细胞和过表达CHMP3的A549稳转细胞系,应用Western Blot技术检测各组诱导前后E-cadherin和Vimentin表达量的变化,评估过表达CHMP3对肺泡上皮细胞EMT进程的影响。3、采用多泡体生成抑制剂U18666A干预A549细胞构建ESCRT系统表达抑制模型。应用Western Blot技术检测U18666A干预条件下ESCRT系统成员TSG101、CHMP1B、CHMP3和VPS4表达量的变化,评估干预效率。分别使用TGF-β诱导、U18666A干预和TGF-β/U18666A联合诱导A549细胞,应用Western Blot技术检测各组诱导前后E-cadherin和Vimentin表达量的变化,评估抑制ESCRT系统成员对于肺泡上皮细胞EMT进程的影响。结果:1、成功构建肺泡上皮细胞EMT模型。TGF-β诱导组相较于对照组细胞形态发生明显改变,由原有的鹅卵石样上皮细胞表型变为细长梭样间质细胞表型。Western Blot结果显示TGF-β诱导组E-cadherin表达增加,Vimentin表达减少。免疫荧光结果显示,TGF-β诱导组E-cadherin和α-SMA表达增加,Vimentin表达减少。Western Blot结果显示TGF-β诱导组ESCRT系统成员CHMP3表达减少。2、成功构建过表达CHMP3的A549稳转细胞系。Western Blot检测发现了外源CHMP3的表达。过表达CHMP3的A549细胞E-cadherin表达减少,Vimentin表达增加均弱于正常A549细胞。3、抑制剂U18666A干预后A549细胞ESCRT系统成员表达受到一定程度的抑制。Western Blot结果显示CHMP3、CHMP1B和VPS4表达均减少但TSG101表达不变。U18666A诱导组E-cadherin表达下调,Vimentin表达上调,但变化趋势没有TGF-β诱导组显著,TGF-β/U18666A联合诱导组较之TGF-β诱导组亦未见显著改变。结论:使用TGF-β诱导A549细胞成功构建了肺泡上皮细胞EMT模型,在该进程中ESCRT系统成员CHMP3表达减少。过表达CHMP3则可以抑制肺泡上皮细胞EMT进程。多泡体生成抑制剂U18666A可以下调CHMP3的表达,促进肺泡上皮细胞EMT进程。
【图文】：
光学显微镜下观察对照组和诱导组 A549 细胞形态变化3.1.2 免疫细胞荧光观察 TGF-β 诱导前后，A549 细胞上皮/间质分子标志物表达变化情况
免疫细胞荧光观察对照组和诱导组 A549 细胞上皮/间质分子标志物表达变化3.1.3 Western Blot 检测 TGF-β诱导前后，A549 细胞上皮/间质分子标志物表达变化情况为了进一步验证 TGF-β 诱导 A549 细胞 EMT 模型构建成功，我们对 10ng/mL
【学位授予单位】：中国医科大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2018
【分类号】：R563
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