氧化应激下肺泡Ⅱ型上皮细胞凋亡和JNK的调控机制

发布时间：2020-06-11 12:06

【摘要】： 第一部分原代大鼠肺泡II型上皮细胞分离、纯化、培养及鉴定 背景 肺泡上皮易受各种应激的损伤,它的损伤后修复主要依赖于肺泡上皮的干细胞——肺泡II型上皮细胞(alveolar type II epithelial cells,ATII cells)。ATII细胞体积较小、呈立方形,占肺泡上皮细胞数的60%左右,能通过增殖、铺展、迁移,并最终转化为肺泡I型上皮细胞(alveolar type I epithelial cells, ATI cells),恢复肺泡上皮正常的形态和功能。另外,ATII细胞还具有很多重要功能:合成、分泌和重新利用表面活性物质;转运离子和水分;合成免疫效应分子。但ATII细胞的原代分离、纯化技术较为复杂,本研究的目的是掌握成年大鼠ATII细胞的分离、纯化和培养技术,以获得数量足够、纯度高的ATII细胞,满足下一步实验的需要。 目的 确定成年大鼠原代ATⅡ细胞分离1、纯化、培养的技术方法,为研究氧化应激下ATⅡ细胞存活、凋亡和信号转导机制提供数量足够和高纯度的ATⅡ细胞,以满足实验的需要。 方法 水合氯醛麻醉清洁级Spraque-Dawley大鼠(约200 g),打开胸腔行肺动脉插管,以生理盐水冲净肺血。整体取出心肺和气管,气管插管,以缓冲液灌洗肺泡腔10次。将0.08%胰蛋白酶消化液从气管注入肺泡,置于37°C,5%二氧化碳(carbon dioxide, CO2)培养箱,每隔5分钟添加适量消化液, 20分钟后,去除气管及肺门周围结缔组织置于250μg/ml脱氧核糖核酸酶Ⅰ(deoxyribonucleaseⅠ, DNaseⅠ)和终止血清混合液中,快速剪肺至1 mm3小块,筛网过滤,离心收集细胞, DMEM/F12培养基重悬细胞并转移至大鼠IgG包被的培养皿中,吸附纯化2 h,用含10%胎牛血清、10u/ml青霉素和100μg/ml链霉素的DMEM/F12培养基重悬细胞,接种于6孔培养板或96孔培养板,细胞接种后24h换液,继续培养12h备用。台盼蓝拒染法测定细胞活力。透射电镜(Transmitting electron microscopy, TEM)鉴定细胞,改良巴式染色法确定细胞纯度。在体外培养细胞不同的时间(36、72、96和120 h)观察细胞的性状和形态变化。 结果 1.细胞的产量约为2×107个/只大鼠。 2.电镜下观察到ATⅡ细胞典型细胞结构——板层小体;改良巴式染色法证实细胞纯度 90%。 3.台盼蓝拒染法测定细胞活力 90%。 4.体外培养36至72 h时细胞生长良好,细胞质内有较多颗粒;96 h以后细胞呈长索形,细胞内颗粒减少,并出现空泡。 结论 利用0.08%胰酶消化分离和大鼠Ig免疫粘附纯化,可获得高产量、高纯度、高活力的原代ATⅡ细胞,能满足实验的需要。ATⅡ细胞体外培养36至72 h时生长良好,可进行体外实验。 第二部分氧化应激诱导肺泡II型上皮细胞的损伤作用及JNK调控作用 背景 氧气疗法是临床上治疗急性呼吸衰竭常用且有效的措施,但长时间高氧暴露可引起氧化应激性肺损伤。高浓度氧气(氧气体积分数 0.95,简称高氧)暴露下产生的活性氧(reactive oxygen species, ROS)是导致氧化应激性肺损伤的主要致病因素。ROS可造成细胞膜脂质的过氧化损伤,蛋白质的应激性修饰,基因的畸变等细胞损伤,导致细胞完整性和功能的破坏。更为重要的是ROS还可通过激活细胞内凋亡信号系统而参与细胞的凋亡。包括c-Jun氨基末端激酶(c-Jun N-terminal kinase, JNK)在内的丝裂原活化蛋白激酶(Mitogen activated protein kinases, MAPKs)家族信号通路是多种刺激通过细胞膜到达细胞核的共同通道。MAPKs主要由JNK、细胞外信号调节激酶(Extracellular signal-regulated kinase,ERK)和p38三条信号通路组成,其中JNK信号通路是一条主要的应激信号通路,在调控细胞的生长、凋亡和免疫反应等方面具有重要作用,但JNK信号的作用因细胞种类、刺激类型而有所差异。氧化应激下ATII细胞的凋亡(在肺损伤和纤维化中具有重要作用)可能涉及JNK信号,但JNK信号在其中起的作用尚不清除。 目的 1.采用过氧化氢(Hydrogen peroxide, H2O2)和无血清培养基建立原代大鼠ATII细胞的氧化损伤模型。 2.研究H2O2对ATII细胞形态、存活和凋亡的影响,探讨细胞损伤与H2O2作用的浓度和时间效应关系。 3.了解氧化应激下ATII细胞凋亡过程中JNK的活化情况,并采用JNK信号抑制剂预先干预,观察其是否能有效抑制H2O2诱导的JNK的活化,从而研究JNK对细胞凋亡的作用。 方法 分离、纯化清洁级Spraque-Dawley成年大鼠的ATⅡ细胞,台盼兰拒染法鉴定细胞活性,改良巴氏染色法鉴定细胞纯度。ATⅡ细胞用不同浓度的H2O2(0μM、50μM、100μM、500μM和1000μM)处理3 h;以500μM H2O2处理不同时间(0 h、1 h、3 h、6 h和9 h);采用倒置相差显微镜细胞形态变化,MTT比色法测定细胞存活率,流式细胞术定量检测凋亡率,以明确细胞损伤与H2O2作用的浓度和时间效应关系。500μM H2O2作用细胞3h后,透射电镜观察细胞凋亡改变。western blot检测500μM H2O2刺激ATⅡ细胞(0、5、10、30、60、180、360和540 min)后p-JNK的表达。在研究JNK信号作用时,细胞随机分为4组:以无血清培养基作用细胞3h,设为对照组(CON组);25μM SP600125(JNK信号特异性抑制剂)预处理,再以无血清培养基作用细胞3 h,设为CON+SP组;以500μM H2O2作用细胞3h,设为H2O2组;细胞预先加入25μM SP600125(JNK信号特异性抑制剂),再以500μM H2O2刺激3 h,设为H2O2+SP组,检测细胞的存活率和凋亡率;荧光显微镜观察荧光染料4,6-二咪基-4-联苯基吲哚(4',6-Diamidino -2- phenylindole, DAPI)染色后细胞核的形态变化。 结果 1.不同浓度H2O2刺激ATⅡ细胞3 h后,与对照组(0μM H2O2)比较,10μM H2O2处理组的细胞生长形态无明显差异;100μM H2O2处理组细胞间隙稍增宽; 500μM H2O2处理组,细胞间隙增宽,体积略减小,部分细胞核浓缩变小,细胞内颗粒(板层小体)减少,1000μM H2O2处理时,大量细胞出现皱缩,变圆,可见细胞脱壁。在500μM H2O2作用细胞不同时间时,与对照组(0 h H2O2)比较,同样发现随处理时间的延长,细胞的形态损害随之加重。 2.透射电镜观察发现500μM H2O2处理3 h后,部分细胞发生典型凋亡改变:细胞体积减小,胞质浓缩,胞膜内陷,多个凋亡小体围绕,小体内可见明显胞核物质。 3.MTT实验结果表明:与对照组(0μM H2O2)相比,50μM、100μM H2O2处理对ATⅡ细胞存活率无明显影响(P 0.05),500μM和1000μM H2O2处理后, ATⅡ细胞存活率呈下降明显(P 0.05)。500μM H2O2处理不同时间后,与对照组(0 h H2O2)比较,随作用时间的延长,细胞存活率逐渐下降,与对照组相比有显著差异(P 0.05)。 4.流式细胞术结果显示:与对照组(0 h H2O2)比较, 500μM H2O2处理ATⅡ细胞不同时间后,随H2O2作用时间的延长, ATⅡ细胞凋亡率呈明显上升趋势(P 0.05)。 5.500μM H2O2刺激后能很快激活JNK,p-JNK的表达在刺激30 min时表达最强,随后其表达逐渐减弱,SP600125预处理能有效抑制H2O2诱导JNK的活化。 6.与H2O2组(500μM H2O2作用细胞3h组)比较,H2O2+SP组(SP600125预处理,再以500μM H2O2作用细胞3h组)细胞存活率上升而凋亡率下降(P均 0.05)。 7.荧光显微镜下发现DAPI染色后正常对照组ATⅡ细胞细胞核形态完整,发出浅蓝色荧光,H2O2组细胞多数细胞核浓集、固缩,发出明亮蓝色荧光,而H2O2+SP组细胞核的损伤较H2O2组减轻。 结论 1. H2O2以浓度和时间依赖的方式诱导ATⅡ细胞损伤。 2.通过流式细胞仪和电镜证实:H2O2刺激可诱导ATⅡ细胞发生凋亡。 3. JNK参与了氧化应激下ATⅡ细胞凋亡信号转导,并对ATⅡ细胞起促凋亡的作用。 第三部分JNK对ATII细胞凋亡相关蛋白及核转录因子表达或活化的调控作用 背景 目前广泛认为在高氧暴露过程中产生的ROS是导致氧化应激性肺损伤的主要致病因素,ROS刺激可引起肺组织细胞的凋亡。近年来,ROS对细胞凋亡的调控作用逐渐引起人们的重视。ATⅡ细胞对维持正常呼吸功能和肺泡上皮完整有十分重要的作用,如果它过度凋亡,肺损伤和组织纤维化将不可避免。越来越多的研究者关注ATⅡ细胞的凋亡,但是氧化应激下ATⅡ细胞凋亡的机制尚不明确。第二部分证实了JNK信号通路参与了氧化应激下ATⅡ细胞凋亡信号转导并对ATⅡ细胞起促凋亡的作用,但JNK究竟通过哪些途径达到促细胞凋亡的作用目前知之甚少。本部分进一步研究ROS对肺泡上皮细胞凋亡相关蛋白表达和核转录因子活化的影响,并探索JNK信号对凋亡相关蛋白表达和核转录因子活化的影响。 目的 1.观察ROS对ATⅡ细胞线粒体膜电位(Mitochondrial transmembrane potential, MMP)的损伤作用。 2.研究ROS对肺泡上皮细胞凋亡相关蛋白表达和核转录因子活化的影响。 3.使用JNK信号抑制剂SP600125,探索JNK信号对氧化应激下ATⅡ细胞凋亡相关蛋白表达和核转录因子活化的影响。 方法 Western blot法检测500μM H2O2刺激前后细胞凋亡相关蛋白(Bax、p53、active caspase-3)和核转录因子NF-κB p65的表达,并采用SP600125阻断JNK信号活化后,研究JNK信号对以上蛋白表达或活化的影响。荧光显微镜和流式细胞仪检测荧光染料JC-1染色后线粒体膜电位的变化。Mitotracker Red标记ATⅡ细胞线粒体,免疫荧光技术检测p53和NF-κB p65,激光共聚焦显微镜观察H2O2刺激前后p53和NF-κB的表达和分布情况。 结果 1. JC-1染色后,荧光显微镜下观察JC-1多聚体(红色荧光)和单体(绿色荧光)的变化情况,发现正常对照组细胞发出鲜艳的红色荧光,无绿色荧光,500μM H2O2刺激后,红色荧光逐渐暗淡,绿色荧光逐渐增强;流式细胞仪检测发现500μM H2O2刺激后,随作用时间的延长,红/绿荧光强度比值逐渐下降。 2. Western blot检测发现,与正常对照组比较,500μM H2O2刺激后,随作用时间的延长,Bax、p53、active caspase-3和NF-κB p65的表达逐渐增加;SP600125预处理可明显降低H2O2刺激后以上相关蛋白的表达。 3.激光共聚焦显微镜下观察发现正常对照组ATⅡ细胞p53和NF-κB p65的表达十分微弱,H2O2刺激后,p53和NF-κB p65的表达明显增加,并且它们都主要分布在细胞核内;SP600125预处理可明显降低H2O2刺激后p53和NF-κB p65的核内表达强度。 结论 1. H2O2刺激能破坏ATⅡ细胞线粒体膜电位,随刺激时间的延长,线粒体膜电位明显下降。 2. H2O2刺激能通过JNK信号通路,明显上调凋亡相关蛋白(Bax、p53、active caspase-3)和转录因子(NF-κB)的表达与活化,从而起到促细胞凋亡作用。 第四部分NAC对氧化应激状态下肺泡II型上皮细胞的调控作用 背景 既然氧化应激下ROS对细胞的死亡起着关键作用,我们认为抗氧化处理可能有助于抑制氧化应激下ATΙΙ细胞的凋亡。N-乙酰半胱氨酸(N-Acetylcysteine,NAC)可作为还原型谷胱甘肽(Reduced Glutathione, GSH)合成的前体,在氧化应激下多种细胞的研究中已显示出其具有良好的抗氧化特性。但目前尚不清楚NAC处理能否对氧化应激下ATΙΙ细胞起到保护作用。本研究探讨NAC对氧化应激下MAPKs激活的影响和ATΙΙ细胞的保护作用。 目的 1.研究NAC预处理能否对氧化应激下的ATⅡ细胞起保护作用。 2.研究NAC预处理对H2O2刺激后ATⅡ细胞内ROS水平及MAPKs激活的影响。 方法 原代培养的大鼠ATⅡ细胞,随机分为4组:正常对照组(CON组)、CON+NAC组、H2O2组和H2O2+NAC组。MTT法检测各组细胞存活率的变化,流式细胞仪检测各组细胞凋亡率和细胞内ROS水平。Western blot检测H2O2刺激及NAC干预后p-JNK、p-ERK和p-p38的表达的变化。 结果 1.与正常对照组比较, H2O2组细胞存活率明显下降(P 0.05),细胞凋亡率明显上升(P 0.05)。 2.与正常对照组比较, H2O2组ATⅡ细胞内ROS水平上升(P 0.05); H2O2刺激后p-JNK、p-ERK和p-p38的表达也明显增加(P0.05)。 3.与H2O2组比较,H2O2+NAC组细胞存活率明显升高(P 0.05),凋亡率明显下降(P 0.05)。 4.与H2O2组比较,H2O2+NAC组细胞内ROS水平明显下降(P 0.05),NAC预处理能明显抑制H2O2诱导的p-JNK、p-ERK和p-p38表达。 结论 氧化应激能激活包括JNK信号在内的MAPKs信号系统,上调ATⅡ细胞内的ROS水平,并诱导ATⅡ细胞凋亡;NAC通过降低细胞内ROS和抑制包括JNK在内的MAPKs的活化,减轻氧化应激下ATⅡ细胞的凋亡而对ATⅡ细胞起保护作用。
【图文】：

图 1 台盼蓝染色(×100)Fig 1 Trypan blue staining of ATⅡ cells(×100) 改良巴氏染色鉴定细胞：ATⅡ细胞细胞质中含有丰富的深蓝

改良巴氏染色鉴定细胞：ATⅡ细胞细胞质中含有丰富的深蓝色颗粒(×400)
【学位授予单位】：重庆医科大学
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2008
【分类号】：R563

【引证文献】

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1 郑锦花;天然抗氧化物拮抗胰岛素抵抗的分子靶点筛选[D];吉林大学;2011年

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本文编号：2707881