NF-kB诱捕ODNs抑制肺成纤维细胞胶原形成的实验研究

发布时间：2020-06-21 02:46

【摘要】： 肺成纤维细胞胶原分泌增加,导致细胞外基质过度沉积是肺纤维化(Pulmonary Fibrosis,PF)的主要病理形态学改变,其分泌的胶原主要是I型和III型。肺成纤维细胞胶原分泌增加是肺纤维化的关键环节,减少肺成纤维细胞胶原表达被认为是治疗肺纤维化的有效方式。细胞因子网络在肺纤维化的发生发展过程中起着重要而复杂的作用,在各种细胞因子中,转化生长因子-β1(Transforming Growth Factor-β1 ,TGF-β1)对肺成纤维细胞胶原分泌的影响作用最大。因此该信号传导途径在肺纤维化中的作用成为近年研究热点。核因子-κB(Nuclear Factor-κB ,NF-κB)能与多种细胞因子上游启动子的特定结合位点作用,从而调节多种细胞因子的基因表达。NF-κB对TGF-β1基因表达的上调作用已在多个实验研究中得到证实,鉴于TGF-β在肺纤维化中的重要作用,通过抑制NF-κB的活性,来抑制TGF-β信号传导途径对肺成纤维细胞胶原分泌的上调作用,从而减少肺成纤维细胞的胶原分泌,可望成为肺纤维化的有效治疗策略。本研究目的是通过阳离子脂质体介导的NF-κB诱捕寡核苷酸策略(decoy-oligonu- -cleotides ,Decoy ODNs)抑制体外肺成纤维细胞NF-κB的活性,观察肺成纤维细胞的Ⅰ型胶原和Ⅲ型胶原表达量变化情况,为肺纤维化治疗探索新的治疗途径。本课题进行了以下两个方面的研究:1、应用肺组织块法、差时贴壁法原代培养、纯化小鼠肺成纤维细胞,TGF-β5ng/ml刺激后用ODNs-脂质体复合物进行干预,采用凝胶电泳阻滞法(Electro- phoretic Mobility Shift Assay,EMSA)检测不同剂量及不同时间点条件下NF-κB的活性变化;2.通过RT-PCR反应检测NF-κB活性被抑制后肺成纤维细胞Ⅰ型胶原和Ⅲ型胶原mRNA表达量。主要结果: 1.应用肺组织块法及差时贴壁法相结合原代培养小鼠肺成纤维细胞,得到高纯度肺成纤维细胞。 2.用EMSA检测NF-κB活性证实,与对照组比较,decoy ODN-脂质体复合物干预肺成纤维细胞后,NF-κB的活性明显下降(P0.05)。decoy ODN浓度为2μg/ml时, NF-κB活性有所下降,不具统计学意义(P0.05),浓度为4μg/ml时NF-κB的活性下降(P0.05),但浓度为8μg/ml时NF-κB的活性最低。decoy ODN干预2小时后即可观察到NF-κB的活性下降,24小时后NF-κB的活性仍未恢复。 3.通过逆转录聚合酶链式反应(reverse transcriptase- polymerase chain reaction,RT-PCR)反应检测NF-κB活性被抑制后肺成纤维细胞Ⅰ型胶原和Ⅲ型胶原mRNA表达量显示,NF-κB活性被抑制后,Ⅰ型胶原和Ⅲ型胶原mRNA的表达量均下降(P0.05),其表达量与NF-κB活性程度呈正相关。decoy ODN干预后2小时,Ⅰ型胶原与Ⅲ型胶原mRNA表达量下降不明显,干预后6小时,胶原mRNA表达量开始下降,到干预后24小时,胶原mRNA表达量仍处于较低水平。主要结论: 1.肺组织块法与差时贴壁法结合应用可有效分离、纯化小鼠肺成纤维细胞。第3～5代细胞适用于以肺成纤维细胞为观察对象的实验研究。 2.阳离子脂质体介导的NF-κB诱捕寡核苷酸策略能有效抑制NF-κB的活性。相对于2μg/ml及4μg/ml,8μg/ml的decoy ODN浓度对NF-κB活性的抑制作用最好。 3.decoy ODN作用于肺成纤维细胞早期即发挥对NF-κB的抑制作用,加入decoy ODN 2小时后NF-κB的活性最低,其对NF-κB的抑制作用至少持续22小时。decoy ODN对NF-κB活性影响的时效关系为该方法的进一步应用提供基本数据。 4.抑制NF-κB的活性能有效减少体外肺成纤维细胞Ⅰ型胶原和Ⅲ型胶原mRNA的表达量,提示抑制NF-κB的活性可减少肺纤维化过程中细胞外基质的沉积。 5.decoy ODN作用于肺成纤维细胞6小时即可抑制胶原mRNA表达,抑制作用至少持续18小时左右。胶原mRNA表达水平与NF-κB的活性呈正相关,进一步证明抑制NF-κB活性的策略可延缓肺纤维化的发展,可望成为肺纤维化的有效治疗方法之一。其实际应用中的价值尚需进一步研究确定。
【学位授予单位】：第三军医大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2008
【分类号】：R563.9
【图文】：

肺组织,纤维细胞,细胞,倒置显微镜

资料用 x ±s表示，采用SPSS13.0软件进行单因5表示差异有统计学意义。结果成纤维细胞的培养天以内的昆明小鼠肺组织经分离、纯化后可获得08, 纯度高达(94±1) % , 台盼蓝拒染实验检测接显微镜下观察，细胞呈长梭形, 细胞亮,30 min 左入对数生长期, 分离纯化后3 d 接近融合, 并彼观察，细胞呈梭形，多突起，胞浆红染，胞核蓝点，如图3。

倒置显微镜,原代培养,上皮样细胞,成纤维细胞

原代培养成纤维细胞（倒置显微镜，×50）：传代三织样细胞 lung fibroblast of Balb/c mice(×50）: after 3th transfer of tive tissue cells left.

【参考文献】