微囊藻毒素-LR诱导人支气管上皮细胞凋亡及其机制研究

发布时间：2017-03-28 19:19

  本文关键词：微囊藻毒素-LR诱导人支气管上皮细胞凋亡及其机制研究，由笔耕文化传播整理发布。

【摘要】：MCs是蓝藻生长过程中释放的代谢产物，是一组具有生物活性的单环七肽化合物，是对人类及动物健康威胁最大的一种细胞内毒素。MCs性质稳定，常规饮用水物理及化学净化处理措施很难将其有效清除。藻毒素从破裂的藻细胞中释放到水体中,可经过口腔摄入、肺部呼吸、皮肤接触以及血液渗透等不同的途径给人类及动物健康造成威胁。有文献报道蓝藻毒素可能会由于水体泡沫以及娱乐过程中产生的浪花等通过肺部呼吸进入到人体，从而可能会引起呼吸系统疾病。 目的 本实验通过建立稳定的微囊藻毒素-LR(Microcystins-LR, MC-LR)染毒人支气管上皮（Human Bronchial Epithelial,16HBE）细胞研究模型，观察MC-LR对16HBE细胞的毒性凋亡作用及凋亡相关蛋白、线粒体途径相关分子表达的影响，旨在阐明MC-LR诱导16HBE细胞的凋亡作用及其可能机制。 方法 1.人支气管上皮细胞活性的测定采用MTT法检测MC-LR对16HBE细胞活性的影响，并找出半数有效浓度（EC50），为后续实验选择毒素浓度提供依据。 2.活性氧测定采用2,7-二氯荧光乙酰乙酸盐(DCFH-DA)法测定16HBE细胞中ROS含量。 3.线粒体膜电位测定JC-1染色法结合流式细胞仪测定荧光强度。 4.细胞凋亡率的测定膜联蛋白V 异硫氰酸荧光素/碘化丙啶(AnnexinV-FITC/PI)双染色结合流式细胞术检测。 5. Caspase抑制剂(z-Val-Ala-Asp(O-methyl)-fluoromethylketone, Z-VAD-FMK）以及Z-VAD-FMK和MC-LR联合暴露分别对16HBE细胞活性影响的测定MTT方法检测活性并找出在后续试验中Z-VAD-FMK的浓度。 6. Western blot检测Caspase-3, Caspase-9, Cyt-c, Bcl-2及Bax蛋白表达量。 结果 1. MC-LR(0,1,10,20,30及40μg/ml)处理16HBE细胞24h后，结果显示随着MC-LR浓度的升高，16HBE细胞的活性逐渐降低。且1,10,20,30及40μg/ml染毒组细胞活性与对照组相比，差异均有统计学意义(P0.05)。 2.当暴露时间一定时，随着MC-LR浓度的升高，16HBE细胞内ROS的含量呈上升趋势。当MC-LR浓度分别为5,10μg/ml时，ROS含量随着暴露时间的增加而增加，差异有统计学意义(P0.05)。 3.当MC-LR浓度为10μg/ml时，不管作用于细胞24h或48h时，与对照组相比，线粒体膜电位均呈下降趋势；且差异均有统计学意义(P0.05)。 4. MC-LR(2.5,5,10μg/ml)处理16HBE细胞24h后，细胞凋亡率分别为6.03%、17.90%、26.10%。当暴露48h后，细胞凋亡率分别为19.40%、23.80%、32.23%。 5. Caspase抑制剂单独作用时，与对照组相比，当Z-VAD-FMK浓度大于100μM时，细胞活性均降低，且差异有统计学意义(P0.05)。当抑制剂与毒素联合作用时，当MC-LR浓度分别为5,10μg/ml，加入的Z-VAD-FMK浓度为10μg/ml时，与未加Z-VAD-FMK组相比，细胞活性降低，差异有统计学意义(P0.05)。 6. Western blot结果显示：暴露于MC-LR24h后，与对照相比，Caspase-3,Caspase-9, Cyt-c及Bax相对表达量升高,而Bcl-2的相对表达量降低，且差异均有统计学意义(P0.05)。MC-LR作用于16HBE细胞48h时，各目的蛋白相对表达量的变化趋势与MC-LR作用24h基本一致。MC-LR暴露于16HBE细胞相同浓度时，Bcl-2相对表达量随暴露时间的增加而降低，其余各蛋白相对表达量增加，具有时间依赖关系。 7.加入caspase抑制剂Z-VAD-FMK预处理后，与不加组相比，，细胞凋亡率明显减少，Caspase-3和Caspase-9的蛋白相对表达量降低，且差异均有统计学意义(P0.05)。 结论 1. MC-LR能导致16HBE细胞发生凋亡。 2. MC-LR诱导16HBE细胞凋亡的可能机制是线粒体Caspase依赖性途径。
【关键词】：微囊藻毒素-LR 人支气管上皮细胞 凋亡机制
【学位授予单位】：郑州大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2014
【分类号】：R562
【目录】：

• 摘要4-6
• Abstract6-9
• 目录9-11
• 图表清单11-12
• 缩略词表12-13
• 1 前言13-16
• 2 材料与方法16-26
• 2.1 细胞株16
• 2.2 实验仪器及试剂16-17
• 2.3 主要试剂配制17-19
• 2.4 实验方法19-25
• 2.4.1 MC-LR 对 16HBE 细胞活性的测定19-20
• 2.4.2 16HBE 细胞中 ROS 的测定20-21
• 2.4.3 16HBE 细胞中线粒体膜电位（MMP）的测定21
• 2.4.4 Caspase 抑制剂 Z-VAD-FMK 对细胞活性的影响21-22
• 2.4.5 加入 Z-VAD-FMK 预处理，MC-LR 对 16HBE 细胞活性的影响22
• 2.4.6 MC-LR 对 16HBE 细胞凋亡率的测定22
• 2.4.7 MC-LR 对 16HBE 细胞线粒体途径相关分子的测定22-25
• 2.5 统计分析方法25-26
• 3 实验结果26-39
• 3.1 MC-LR 对 16HBE 细胞活性的影响26-27
• 3.2 不同浓度的 MC-LR 对 16HBE 细胞内 ROS 的影响27-28
• 3.3 不同浓度的 MC-LR 对 16HBE 细胞线粒体膜电位的影响28-29
• 3.4 Caspase 抑制剂 Z-VAD-FMK 对细胞活性的影响29-30
• 3.5 加入 Z-VAD-FMK 预处理后 MC-LR 对细胞活性的影响30-31
• 3.6 不同浓度 MC-LR 对 16HBE 细胞凋亡率的影响31-33
• 3.7 MC-LR 对 16HBE 细胞中凋亡相关蛋白表达的影响33-35
• 3.8 MC-LR 对 16HBE 细胞中线粒体途径中相关分子表达的影响35-39
• 4 讨论39-43
• 4.1 细胞模型的建立39
• 4.2 MC-LR 对 16HBE 细胞活性及凋亡的影响39-40
• 4.3 ROS 参与 MC-LR 诱导 16HBE 细胞凋亡的调节40-41
• 4.4 MC-LR 对 16HBE 细胞中凋亡相关蛋白的影响41
• 4.5 MC-LR 对 16HBE 细胞中线粒体途径相关蛋白的影响41-43
• 5 结论43-44
• 参考文献44-48
• 综述48-63
• 参考文献57-63
• 个人简历63-64
• 致谢64

【参考文献】

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  本文关键词：微囊藻毒素-LR诱导人支气管上皮细胞凋亡及其机制研究，由笔耕文化传播整理发布。

本文编号：272896