mTOR-Cdc42信号通路在PM2.5加剧慢性阻塞性肺疾病小鼠肺泡巨噬细胞吞噬功能障碍中的作用及机制研究

发布时间：2020-06-28 15:14

【摘要】：目的:探讨哺乳动物雷帕霉素靶蛋白-细胞分裂周期蛋白(mTOR-Cdc42)信号通路在PM2.5加剧慢性阻塞性肺疾病(慢阻肺)小鼠肺泡巨噬细胞(AM)吞噬功能障碍中的作用及机制。方法:将50只SPF级雄性8周龄BALB/c小鼠,采用随机数字表法分为正常对照(A)组、慢阻肺(B)组、PM2.5慢阻肺(C)组、表没食子儿茶素没食子酸酯(EGCG)慢阻肺(D)组、EGCG+PM2.5慢阻肺(E)组,每组10只。采用单纯香烟烟雾持续暴露90d建立慢阻肺小鼠模型。采集兰州市城关区大气中的PM2.5,C组和E组给予PM2.5(720?g/m3)持续雾化吸入90d,A组、B组和D组给予同等体积的生理盐水雾化吸入。采用不连续密度梯度离心法分离小鼠AM,调整细胞数为2×106/ml,D组和E组EGCG终浓度为40μmol/L,孵育24h。采用小鼠无创体描箱检测肺功能,处死小鼠,取左肺下叶,行病理学检查。采用流式细胞术检测AM吞噬异硫氰酸荧光素标记的大肠杆菌(FITC-E.coli)的能力。采用实时荧光定量聚合酶链反应(RT-PCR)和蛋白印迹法(WB)检测mRNA及蛋白的表达。采用小G蛋白活性检测(G-LISA)试剂盒检测Cdc42的活性。采用激光共聚焦显微镜观察细胞骨架。结果:(1)慢阻肺模型的肺功能及肺组织病理学改变:B组吸气峰流速(PIF)、呼气峰流速(PEF)和呼出50%潮气量时的流速(EF50)(7.5±1.0、4.67±0.6、3.29±0.43)显著低于A组(11.61±1.12、7.63±0.44、5.05±0.37)(均P0.01);C组(4.96±0.91、3.34±0.48、2.14±0.29)显著低于B组(均P0.01)。C组小鼠肺组织中可见明显的支气管炎症和肺气肿改变,较B组程度严重,A组小鼠肺组织无此病理改变。(2)AM的吞噬功能:B组平均荧光强度(MFI)和吞噬FITC-E.coli阳性细胞百分比(吞噬%)(4060±590、28.65±1.26)显著低于A组(9190±988、67.50±4.56)(均P0.01);C组(2932±700、18.41±1.48)显著低于B组(均P0.01);D组(5046±732、39.07±1.33)显著高于B组(均P0.01);E组(4018±578、28.14±1.35)显著高于C组(均P0.01)。(3)AM mTOR mRNA、蛋白及活性(p-mTOR):B组mTOR mRNA、蛋白及活性(2.62±0.46)(1.30±0.52)(1.46±0.43)均显著高于A组(1.00±0.00)(0.48±0.27)(0.58±0.26)(均P0.01);C组(3.61±0.52)(2.50±0.47)(2.66±0.52)显著高于B组(均P0.01);D组(1.83±0.43)(0.91±0.31)(0.97±0.31)显著低于B组(P0.01、P0.05);E组(2.84±0.49)(1.84±0.43)(1.90±0.44)显著低于C组(均P0.01)。(4)AM Cdc42 mRNA、蛋白及活性:B组mRNA、蛋白及活性(2.56±0.50)(1.61±0.37)(0.46±0.09)显著高于A组(1.00±0.00)(0.67±0.22)(0.30±0.07)(均P0.01);C组(3.66±0.54)(2.70±0.48)(0.62±0.10)显著高于B组(均P0.01);D组(1.77±0.44)(1.00±0.30)(0.37±0.08)显著低于B组(P0.01、P0.05);E组(2.67±0.48)(2.00±0.57)(0.52±0.06)显著低于C组(均P0.01)。(5)AM细胞骨架:B组细胞周围可见明显的丝状伪足和板状伪足;C组细胞形状不规则,细胞周围丝状伪足伸出杂乱、长短不一,板状伪足面积增加;D组细胞周围可见少量丝状伪足和板状伪足;E组细胞变圆,丝状伪足较少,排列相对整齐,细胞与细胞接触的部分出现膜皱褶;A组细胞形状规则,未见上述改变。(6)相关性分析:基础状态、PM2.5干预、EGCG干预及PM2.5联合EGCG干预后小鼠AM mTOR、Cdc42的mRNA、蛋白及活性与MFI均呈负相关(P0.01、0.05);基础状态、PM2.5干预、EGCG干预及PM2.5联合EGCG干预后小鼠AM mTOR的mRNA、蛋白及活性与Cdc42的mRNA、蛋白及活性均呈正相关(P0.01、0.05)。结论:1.单纯香烟烟雾持续暴露可成功复制慢阻肺小鼠模型;2.慢阻肺小鼠AM吞噬功能降低,PM2.5加剧慢阻肺小鼠AM吞噬功能障碍;3.mTOR-Cdc42信号通路在慢阻肺小鼠AM中处于活化状态,PM2.5促进该信号通路活化;4.mTOR-Cdc42信号通路活化致AM细胞骨架不恰当重排与AM吞噬功能低下相关;5.EGCG抑制慢阻肺mTOR-Cdc42信号通路,增强慢阻肺小鼠AM吞噬功能。
【学位授予单位】：兰州大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2016
【分类号】：R563.9
【图文】：

香烟烟雾,小鼠,慢阻肺,熏烟

兰州大学硕士研究生学位论文 mTOR-Cdc42 信号通路在 PM2.5 加剧慢阻肺小鼠 AM 吞噬功能缺陷中的作用及机制研究隔 3-4h，连续熏烟 90d（图 1）。

肺功能测定,肺功能,小鼠,评定指标

2.1.2 肺功能测定参照文献[96-97]于造模结束后，行小鼠无创肺功能测定，将小鼠置于无创全体体积描记箱内，在清醒、自由活动状态下，行无创肺功能测试，选取吸气峰流速（PIF）、呼气峰流速（PEF）和呼出 50%潮气量时的流速（EF50）作为小鼠肺功能的评定指标，进行统计学分析（图 2）。

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