人胸膜间皮细胞水通道蛋白的表达及其调控

发布时间：2020-07-09 20:02

【摘要】： 前言为了适应胸腔内液体的平衡严格控制，胸壁和肺之间要有一种液体吸收和滤出的机制，液体由壁胸膜通过压力梯度滤出，由脏层胸膜经压力差、渗透梯度、脏胸膜的淋巴微孔及细胞机制吸收。胸膜间皮细胞在液体吸收中有重要功能，具有离子转运功能及蛋白微泡转运功能，研究表明胸膜间皮细胞是具有一定通透性的屏障系统，与血管内皮细胞是相同的。研究证实胸壁的淋巴微孔对微粒及细胞、蛋白的吸收中起重要的作用，而在液体吸收中不起主要的作用。研究发现间皮细胞不仅是完整浆膜腔的组成部分，它参与液体的转运，有干细胞的功能，参与炎症反应，参与损伤的修复，防止浆膜腔内的粘连与肿瘤转移。间皮细胞细胞膜上的水通道蛋白可能在胸腔内液体的吸收中起重要作用。水是生物机体细胞的主要成分，时时有大量的水分子通过细胞膜进出细胞。在纯化的人的红细胞膜上Rh蛋白时，发现了一种新的膜蛋白，能明显加快水的转运。证实它对水有特殊的通透性，后来正式称为水通道蛋白(Aquaporins：AQPs)，目前已发现13种水通道蛋白亚型，按顺序分别命名为AQP_0～AQP_(12)，它们形成了一个AQPs家族。水通蛋白中AQP_1、AQP_2、AQP_4、AQP_5和AQP_8主要参与水的选择性转运；AQP_3、AQP_7、AQP_9、AQP_(10)参于水和非极性小分子的转运如：甘油、尿素、嘌呤、嘧啶、呼吸道和肺组织目前发现有AQP_1、AQP_3、AQP_4、AQP_5、AQP_8五种AQP表达。2人胸膜或人胸膜间皮细胞上水通道蛋白的表达情况尚无报道。为研究间皮细胞在胸腔内液体转运中的作用，本课题分离培养原代胸膜间皮细胞，研究其在体外培养时的生物学特性；并对不同标本来源的间皮细胞进行对比。以原代间皮细胞为研究对象检测其水通道蛋白mRNA的表达及调控。对于认识间皮细胞的功能及探讨胸膜腔内液体的转运机理有重要价值。实验材料与方法一、胸膜间皮细胞的分离与培养利用两种取材方法建立人胸膜间皮细胞(HPMC)体外培养模型，一是用胰蛋白酶-EDTA消化法，从人肺脏胸膜及壁胸膜上分离胸膜间皮细胞；二是从胸腔积液中分离胸膜间皮细胞；进行胸膜间皮细胞的体外培养。用形态学和免疫细胞化学方法对培养所得细胞进行鉴定。二、胸膜间皮细胞水通蛋白1～10 mRNA表达的检测利用体外培养的原代人胸膜间皮细胞，检测人胸膜间皮细胞水通道蛋白1～10mRNA的表达，用RT-PCR(reverse transaiption polyrmrease chain reaction)检测水通道蛋白1～10(AQP_(1～10))mRNA在人胸膜间皮细胞上的表达。三、地塞米松对人胸膜间皮细胞水通道蛋白1 mRNA表达的影响脏层与壁层胸膜组织标本，应用免疫组织化学染色方法检测其AQP_1蛋白水平的表达；体外培养的人胸膜间皮细胞，给于糖皮质激素(地塞米松)和糖皮质激素受体阻断剂(RU486)干预，研究地塞米松对人胸膜间皮细胞AQP_1mRNA表达的影响。用RT-PCR检测人胸膜间皮细胞上AQP_1 mRNA的表达情况。实验分三组：地塞米松组；地塞米松+RU486；对照组。分别给于不同浓度的药物，作用不同时间，检测不同组人胸膜间皮细胞AQP_1 mRNA表达的差异。结果一、细胞的分离与培养倒置显微镜下可见细胞汇合后呈多角形铺路石样，电镜下可见丰富的微绒毛和内质网，免疫细胞化学染色结果显示角蛋白、波形蛋白表达阳性，抗Ⅷ因子相关单克隆抗体、抗人白细胞CD_(45)表达阴性；排除了成纤维细胞、白细胞及内皮细胞的可能性；证实为人的胸膜间皮细胞。两种方法得到的细胞纯度均在98％以上；具有较好的细胞活力。两种取材方法均可以成功建立间皮细胞体外培养模型，方法学上均有可行性。二、水通蛋白1～10 mRNA表达人胸膜间皮细胞上AQP_(1～10)mRNA均有表达，AQP_1、AQP_9、AQP_(10)表达丰富。结合已知它们的功能，证实人胸膜间皮细胞参于胸腔内液体转运用其它小分子物质的转运。三、地塞米松干预实验人脏层胸膜与壁层胸膜间皮细胞上均存在AQP_1蛋白的表达，且胸膜下血管内皮与红细胞上也存在AQP_1蛋白的表达；地塞米松可以增加AQP_1 mRNA的表达，且有剂量依赖性特点，干预组与其它两组比有显著的统计学差异(P＜0.001=.AQP_1的主要功能是参与水的跨膜转运，地塞米松增加胸膜间皮细胞上AQP_1mRNA的表达，为胸腔积液的治疗提供理论依据。结论一、两种取材方法均可以成功建立间皮细胞体外培养模型，方法学上均有可行性；手术标本所得细胞有较高的细胞纯度，取材上胸腔积液更易于得到。第二至三代细胞具有较好的活力，符合实验的要求。二、人胸膜间皮细胞存在AQP_(1～10) mRNA的表达，结合已知它们的功能，进而证实人胸膜间皮细胞参于胸腔内液体转运。三、胸膜间皮细胞上有AQP_1蛋白的表达和基因的表达，AQP_1的主要功能是参与水的跨膜转运，地塞米松增加胸膜间皮细胞上AQP_1mRNA的表达，为胸腔积液的治疗提供理论指导。
【学位授予单位】：中国医科大学
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2007
【分类号】：R561
【图文】：

透射电镜,间皮细胞,倒置显微镜

、人胸膜间皮细胞的形态学鉴定倒置相差显微镜下可见:人胸膜间皮细胞呈多形性，星状、多角形占多数，细胞汇合后呈多边形铺路石样(图1、图2);透射电镜(图3)与扫描电镜(图4)下可见:细胞表面有微绒毛，细胞浆内丰富的内质网和线粒体，未见Welbel一Palade小体.二、免疫组化鉴定采用免疫组化SABC法，分别做抗人波形蛋白、抗人角蛋白、抗人白细胞CD45、抗Vnl因子相关抗原的单克隆抗体4种染色;染色结果为抗人波形蛋白(图5)、抗人角蛋白染色阳性(图6)，抗人白细胞CD45、抗Vlll因子相关抗原的单克隆抗体阴性(图6、图7)。三、细胞活力和纯度消化分离间皮细胞的活细胞率在97%以上;胸腔积液得到间皮细胞的活细胞率为95%.消化分离的间皮细胞纯度在98%以上，胸腔积液分离的间皮细胞纯度在96%左右.

透射电镜,倒置显微镜,间皮细胞,活细胞率

透射电镜,透射电镜,间皮细胞,活细胞率

【共引文献】