鼠肺成纤维细胞在细胞外基质支架中生长特性的实验研究

发布时间：2020-07-19 22:27

【摘要】： 目的:建立一套可靠的鼠肺成纤维细胞分离、纯化和培养技术,并研究鼠肺成纤维细胞在细胞外基质支架中的生长特性,进而为体外研究间质性肺病的发病机制及治疗提供一种新的方法。方法: 1、采用胰酶消化出生后2 d SD大鼠肺组织块,经差时贴壁法,分离、纯化鼠肺成纤维细胞,并进行原代培养。用波形蛋白免疫荧光染色、扫描电镜和蛋白质印迹法对所分离、纯化的细胞进行鉴定,并绘制其生长曲线。 2、将纤维蛋白原、层粘连蛋白和纤粘连蛋白按一定比例混合后,在新鲜大鼠血浆促凝作用下,构建单层毯状细胞外基质支架。将原代培养并纯化传代的鼠肺成纤维细胞分别植入支架及加入转化生长因子-β_1的支架,应用倒置显微镜、免疫荧光、扫描电镜、MTT法、Real-time PCR和免疫印迹方法观察鼠肺成纤维细胞在三维培养中的生长特性。结果: 1、该方法所得细胞产量大、纯度高。鼠肺成纤维细胞免疫荧光染色波形蛋白阳性。扫描电镜观察可见细胞有微绒毛,细胞间连接成网状。免疫印迹检测显示波形蛋白表达。生长曲线提示细胞增殖稳定。 2、鼠肺成纤维细胞在细胞外基质支架及加入转化生长因子β_1的支架中细胞增殖、转化及Ⅰ型胶原、MMP-2、TGF-β_1合成能力均明显强于普通单层培养。结论: 1、该方法是一种可靠的鼠肺成纤维细胞分离纯化培养技术。 2、鼠肺成纤维细胞在细胞外基质支架中有良好的生长特性,为体外研究成纤维细胞在肺间质纤维化中的作用提供了一种新的方法。
【学位授予单位】：江苏大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2009
【分类号】：R563
【图文】：

原代培养,倒置显微镜

2.2.1倒置显微镜细胞形态观察原代培养5一7d即有新生细胞长出，为成纤维细胞型，贴壁生长。初时细胞形态多样化，但多为类圆形，带有粗大突起(图2一la)，分离纯化后3d后变为长梭形、条索状，融合成片(图2一lb)，第7天后彼此连接成网状，分界较为模糊(图2一Ic)。图2一 1LF原代培养倒置显微镜观察2.2.2免疫荧光鉴定肺成纤维细胞vimentin免疫荧光染色阳性，即胞浆内围绕细胞核呈红色丝状网络形态，犹如树叶的叶脉，阳性率在95%以上， Hoechst33342标记细胞核为蓝色(图2一2)。

生长曲线,扫描电镜,原代培养

江苏大学硕士学位论文图2一 2LF原代培养免疫荧光鉴定A:vimel飞titl阳性呈红色/40)B:核荧光阳性呈兰色/4的2.2.3扫描电镜鉴定取生长状态良好的成纤维细胞扫描电镜示成纤维细胞呈长梭形，细胞有微绒毛，细胞间连接成网状，并分泌胶原纤维等细胞外基质(图2一3)。图2一 3LF原代培养扫描电镜鉴定扫描电镜 x55050tlm2.2.4蛋白质印迹法鉴定第3代生长良好的成纤维细胞蛋白提取后行蛋自质印迹法测定波形蛋白较强表达(图2一4)。......少 VIMENI’!N(玉APDH图2一4L下了原代培养western一blot鉴定vime;lti:1蛋白表达2.2.5鼠肺成纤维细胞生长曲线MTT比色法测定是个快速简便的颜色反应的测定，活细胞线粒体中的玻泊酸脱氢酶能够将黄绿色的MTT还原成蓝紫色的甲攒，而MTT在死亡细胞内不能

生长曲线,原代培养,免疫荧光

【参考文献】