u-PA及PAI-1在小鼠实验性肺气肿发生发展中的作用及其机制

发布时间：2020-07-20 19:55

【摘要】： 肺气肿是慢性阻塞性肺疾病的终末阶段,主要表现为肺泡间质成份(胶原和弹力纤维蛋白)破坏,终末细支气管远端(包括呼吸细支气管、肺泡管、肺泡囊、肺泡)的过度充气和扩大。肺气肿的发生发展与肺脏间质蛋白降解破坏关系密切。肺脏间质蛋白的降解酶主要包括纤溶酶和基质金属蛋白酶(Matrixmetalloproteinases,MMPs)等。纤溶酶和基质金属蛋白酶的含量及活性的改变影响肺气肿的发生发展。同肺间质蛋白分解相关的基质金属蛋白酶主要包括MMP-2,MMP-9,MMP-12等。MMP-2和MMP-9主要降解基质胶原蛋白;MMP-12主要降解基质弹力纤维蛋白。抑制肺间质蛋白分解的酶主要是基质金属蛋白酶抑制剂-1(TIMP-1),通过与MMP-2,MMP-9等基质金属蛋白酶结合,降低其活性,减少肺间质破坏并促进修复。 u-PA是丝氨酸蛋白酶蛋白酶家族中的重要成员之一,可作用于纤溶酶原和基质金属蛋白酶。u-PA与其受体uPAR结合,激活细胞周围基质中纤溶酶原(plasminogen,plg)转交为纤溶酶(plasmin,plm),后者激活相应G蛋白受体,发挥信号分子的作用。u-PA还可通过激活基质金属蛋白酶原成为活性酶形式,降解细胞外基质蛋白;在组织间质损伤修复中也发挥重要作用。因此u-PA可能与肺气肿的发生发展有一定关系。在此,我们首次使用u-PA基因敲除小鼠研究u-PA对老年性肺气肿样改变的影响及其分子机制。通过提取15天(低龄组)及4月(高龄组)龄野生型小鼠和u-PA基因敲除小鼠肺组织进行HE染色比较不同基因型小鼠肺组织形态,结果显示低龄组u-PA基因缺失小鼠相比野生型(WT)小鼠肺组织形态无明显差异,高龄组野生型小鼠肺泡扩大,肺间质破坏明显。相比之下,u-PA基因缺失小鼠肺泡壁结构较完整,肺泡腔无明显增大。为进一步分析产生上述差异的原因,我们应用图像分析软件image pro plus v5.0结合weigert弹力纤维蛋白染色,对肺间质弹力纤维等肺组织成份进行半定量分析(weigert弹力纤维染色阳性部分占总高倍视野面积蛋白),结果显示高龄组u-PA基因缺失小鼠肺弹力纤维含量显著高于野生型小鼠(P＜0.05),低龄组两者无显著差异。Real-time PCR检测弹力蛋白(Elastin),MMP-12和TIMP-1的表达水平,结果显示高龄组u-PA基因缺失小鼠肺组织Elastin和TIMP-1的mRNA表达显著高于野生型小鼠(P＜0.01),同时MMP-12的mRNA也略有升高,低龄组无显著差异。以上结果说明,u-PA基因缺失减轻了小鼠实验性老年性肺气肿样改变,分析其分子机制可能是u-PA基因缺失后,导致弹力蛋白和TIMP-1基因的表达升高,肺组织弹力纤维含量增加所致。肺气肿是慢性阻塞性肺疾病的终末阶段,主要表现为肺泡间质成份包括胶原和弹力纤维蛋白的破坏,终末细支气管远端(包括呼吸细支气管、肺泡管、肺泡囊、肺泡)的过度充气和扩大。肺脏间质蛋白的降解酶主要包括纤溶酶和基质金属蛋白酶(Matrix metalloproteinases,MMPs)等。其中MMP-2和MMP-9主要降解基质胶原蛋白,MMP-12主要降解基质弹力纤维蛋白。基质金属蛋白酶抑制剂—1(TIMP-1)是基质金属蛋白酶家族最重要的抑制剂,同MMP-2,MMP-9等基质金属蛋白酶结合,降低其酶活性,减少肺间质破坏并促进修复。纤溶酶原激活物抑制物-1(plasminogen activator inhibitor-1,PAI-1)是目前所发现的纤溶酶原激活物(tissue plasmingen activator,t-PA;urokinase typeplasminogen activator,u-PA)抑制物中作用最强的蛋白质分子。由于uPA,tPA能够激活基质金属蛋白从酶原形式变为活性形式,后者是胶原及弹性蛋白等基质蛋白的主要降解酶类。因此,PAI-1可能参与了细胞外基质蛋白的代谢并在老年性肺气肿中发挥了一定的作用。我们首次使用PAI-1基因敲除小鼠研究PAI-1在老年性肺气肿发生发展中的作用。通过肺组织病理学切片(组织HE染色)分析,比较1天、3月、6月龄PAI-1基因敲除小鼠与野生型小鼠在肺脏结构差异,结果显示PAI-1基因缺失小鼠高龄组肺间质破坏明显,肺泡腔扩大:为进一步分析产生上述差异的原因,我们应用羟脯氨酸含量测定分析肺组织胶原蛋白含量,结果显示PAI-1基因缺失虽引起肺间质破坏,但胶原含量高于野生型小鼠;weigert弹力纤维染色结合image pro plusv5.0图象分析软件半定量分析肺脏弹力纤维蛋白含量,显示PAI-1基因缺失导致肺弹力纤维蛋白含量降低,且随鼠龄增加,弹力纤维减少量增加,弹力纤维空间结构破坏严重;我们通过明胶酶谱试验,western blot检测主要的胶原降解酶MMP-2、MMP-9和弹力纤维降解酶MMP-12的蛋白含量,结果显示PAI-1基因缺失小鼠MMP-2、MMP-9活性较野生型小鼠低,而MMP-12蛋白含量升高明显;免疫组化、免疫荧光结果进一步证明PAI-1基因缺失可引起肺间质MMP-12蛋白分泌量的增加;real-time PCR试验分析胶原、弹力纤维、基质金属蛋白酶(包括MMP-12、MMP-9)、基质金属蛋白酶抑制物-1(TIMP-1)、转化生长因子—1(TGF-β1)的相对mRNA表达水平,结果显示PAI-1基因缺失可引起MMP-12mRNA表达升高,高龄组小鼠同时具有较高的弹力纤维mRNA表达。我们认为,PAI-1基因缺失促进MMP-12表达水平的升高,MMP-12蛋白分泌的增加导致小鼠肺弹力纤维降解,造成小鼠肺组织空间结构完整性的破坏。高龄小鼠肺组织内弹力纤维及TIMP-1基因表达水平升高可能是一种代偿性的改变,此改变未能完全代偿PAI-1缺失导致的肺组织结构破坏。PAI-1基因在肺脏空间结构完整性的保护方面发挥着重要的作用。
【学位授予单位】：复旦大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2008
【分类号】：R563.3
【图文】：

肺组织,HE染色,小鼠,弹力纤维

试验结果织级片彩杀学天鼠龄的野生型小鼠肺组织切片陇染色(图IA)同u一PA基因敲除IB)相比，肺组织结构形态无明显差异;Weigert弹力纤维弹力纤维le、n)及加ageproplusv5.0软件分析(图3)证实两种基因型小鼠中弹力纤维含量在肺组织中的比例相近，无统计学差异。4月龄WT织切片现染色(图ZA)同u一PA基因敲除小鼠(图ZB)相比，野生泡壁有明显的破坏，肺泡直径增大。Weigert弹力纤维弹力纤维染色也证实野生型小鼠肺间质中弹力纤维结构较u一PA基因敲除小鼠(图ZD重。软件分析结果(图3)证明弹力纤维的组织含量野生型小鼠为(255)%，明显少于u一PA基因敲除小鼠(34.70士2.12)%(p<0.05)。

月龄,肺组织,小鼠,HE染色

图24月龄小鼠肺组织切片HE、Weigert弹力纤维染色Fig24thmontholdmieelungseetionswithHEandWeigertstain图A:4月龄野生型小鼠肺组织切片HE染色(放大X200)

论文,基因缺失,弹力纤维,肺组织

硕_l.论文第一部分1116660.3612220.3248880.2442220.3738881117770.3482220.3761110.229990.326444lll8880.3543330.3412220.2314440.352222lll9990.3345550.3396660.2593330.324999222OOO0.3438880.3577770.2345550.331888XXXXX0.011977770.018663330.013471110.02118777AAAverageee0.3475550.352055550.251425550.34708555

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