GSTM5在TNF-α介导的人支气管上皮细胞炎症-氧化应激环路中的调控作用

发布时间：2020-07-27 16:05

【摘要】：一、研究目的:构建Nox1启动子活性表达载体pGL6-Nox1,探究GSTM5对TNF-α介导的16HBE细胞Nox1启动子转录活性的调控作用;筛选TNF-α介导的16HBE细胞GSTM5核内差异结合蛋白;探究GSTM5对TNF-α介导的16HBE细胞核内组蛋白H3谷胱甘肽化水平的作用。二、研究方法1、探究GSTM5对TNF-α介导的16HBE细胞Nox1启动子转录活性的调控作用。(1)构建pGL6-Nox1质粒提取人外周血DNA,PCR得到Nox1启动子-1415~0片段,经Xho I与Hind III双酶切pGL6载体回收线性pGL6片段,pGL6片段与Nox1片段经DNA连接酶连接过夜后,转化感受态后铺筛选平板,培养12h后挑选菌落,提取质粒双酶切鉴定,并送测序。(2)上调GSTM5表达对TNF-α介导16HBE细胞Nox1启动子转录活性的作用实验分4组:过表达GSTM5组:16HBE-GSTM5-N与16HBE-GSTM5-C组,阴性对照组16HBE-NC与空白对照16HBE组。所有分组每孔均转染pGL6-Nox1(500ng),pRL-TK(50ng)双荧光素酶质粒,转染6h后各组细胞中刺激组培养液更换为10 ng/mL TNF-α的DMEM培养基,阴性组更换为DMEM培养基。24h后收取各组蛋白上机检测,比较TNF-α刺激后各组的Nox1相对荧光素酶活性上升比率。(3)下调GSTM5表达对TNF-α介导16HBE细胞Nox1启动子转录活性的作用实验分3组:GSTM5低表达组:转染GSTM5siRNA;阴性对照组:转染control siRNA;空白对照组:只转染pGL6-Nox1,pRL-TK质粒。所有分组每孔均转染pGL6-Nox1(500ng),pRL-TK(50ng)双荧光素酶质粒,转染6h后各组细胞中刺激组培养液更换为10 ng/mL TNF-α的DMEM培养基,阴性组更换为DMEM培养基。24h后收取各组蛋白上机检测,比较TNF-α刺激后各组的Nox1相对荧光素酶活性上升比率。2、筛选TNF-α介导的16HBE细胞GSTM5核内差异结合蛋白将GSTM5稳转株分2组:GSTM5-N组与GSTM5-C组,每组再分实验细胞和对照细胞。用SILAC重链同位素培养基培养各组实验细胞,SILAC轻链同位素培养基培养对照细胞,培养至同位素标记效率达95%以上后,实验组更换为10ng/ml TNF-α相对应的重链同位素培养液培养,对照组更换为无TNF-α相对应的轻链同位素培养液培养,0.5h后收集细胞,每组中的实验组和对照组分别取等量的细胞混合并提取核蛋白,蛋白混合物用flag抗体做免疫共沉淀;两组共沉淀蛋白复合物分别经过质谱鉴定和比较分析,得到在TNF-α刺激与无刺激条件下GSTM5蛋白的互作蛋白并进行筛选。3、探究GSTM5对TNF-α介导的16HBE细胞核内组蛋白H3谷胱甘肽化水平的调节作用(1)TNF-α介导的16HBE细胞核内组蛋白H3谷胱甘肽化水平时间变化趋势将16HBE细胞分为TNF-α刺激0小时组、0.5小时组、1小时组、6小时组、12小时组和24小时组。用含TNF-α10ng/ml的DMEM培养基培养各组细胞至相对应时间结束收集细胞。所有分组细胞均用酸提法提取细胞核内组蛋白,蛋白印迹法检测各组组蛋白H3蛋白谷胱甘肽化水平。(2)上调GSTM5表达对TNF-α介导的16HBE细胞组蛋白H3的谷胱甘肽化水平的调节作用实验分三组:过表达组:GSTM5稳转株细胞;阴性对照组:稳转株对照细胞;空白对照组:16HBE细胞组。各组内再分实验组和对照组,实验组用TNF-α(10 ng/mL)刺激12小时,对照组不加任何刺激,正常培养。在刺激12h后上收取所有细胞,酸提法提取细胞核组蛋白,蛋白印迹法检测各组TNF-α刺激前后核内组蛋白H3蛋白谷胱甘肽化水平变化。三、研究结果1、构建Nox1荧光素酶表达载体pGL6-Nox1,探究GSTM5对TNF-α介导的16HBE细胞Nox1启动子转录活性的调节作用(1)构建Nox1荧光素酶表达载体pGL6-Nox1提取的pGL6-Nox1质粒经XhoⅠ或Hind III单酶切后电泳呈一长约7000 bp线性条带;经XhoⅠ、Hind III双酶切后电泳见两条亮带,其一亮带长1415 bp的为Nox1启动子,另一亮带长约5580 bp为pGL6载体。经Nox1引物PCR得到一长约1415bp的片段。经华大基因测序后与人Nox1启动子完全比对。证实pGL6-Nox1质粒构建成功。(2)上调GSTM5表达对TNF-α介导的16HBE细胞Nox1启动子转录活性的作用结果:GSTM5-N及GSTM5-C组Nox1相对荧光素酶活性上调比率均较阴性对照组、空白组低(1.7100±0.0657,1.6733±0.0757,1.9467±0.0472,2.115±0.109),差异有统计学意义(P0.05);GSTM5-N与GSTM-C组之间相对荧光素酶活性上调比率对比差异无统计学意义(P0.05)。(3)下调GSTM5表达对TNF-α介导的人支气管上皮细胞Nox1启动子转录活性的作用GSTM5低表达组相对荧光素酶活性上调比率较空白对照组,阴性对照组均高(2.633±0.0808,1.8400±0.1039,1.9467±0.1011,P0.05),差异有统计学意义(P0.05)。2、筛选TNF-α介导的16HBE细胞GSTM5核内差异结合蛋白(1)质谱鉴定共沉淀下的蛋白复合物通过质谱鉴定分析,并取两组细胞的共有蛋白,经过筛选得到16种蛋白。分别为皮离蛋白(Dermcidin)、桥粒斑蛋白(Desmoplakin)、组蛋白H3F3C(histoneH3)、高迁移率族蛋白B1(High mobility group protein B1)、H2aj(Histone cluster 1,H2aj)、脂肪酸结合蛋白5(Fatty acid binding protein5)、连接桥粒斑珠蛋白(Junction plakoglobin)、纤溶酶原激活物抑制剂1 RNA结合蛋白(SERPINE1 mRNA binding protein 1)、膜结合蛋白A2(Annexin A2)、H2bl(Histone cluster 1,H2bl)、肌动蛋白(Actin,gamma 1)、H1b(Histone cluster 1,H1b)、核仁螺旋体磷酸化蛋1(Nucleolar and coiled-body phosphoprotein 1)、H1e(Histone cluster 1,H1e)、丝氨酸蛋白3(Protease,serine,3)、及钙调蛋白样蛋白5(Calmodulin-like 5)。(2)蛋白一级相互作用分析通过蛋白STRING数据库对质谱鉴定筛选出的16种蛋白进行一级相互作用分析,其中组蛋白Histone H3F3C、组蛋白H2aj、组蛋白H2bl、组蛋白H1b、组蛋白H1e、高迁移率族蛋白B1、钙调蛋白样蛋白5及肌动蛋白之间存在相互关系,连接桥粒斑珠蛋白与桥粒斑蛋白之间存在相互作用关系。3、探究GSTM5对TNF-α介导的16HBE细胞核内组蛋白H3谷胱甘肽化修饰水平调节作用(1)TNF-α介导的16HBE细胞核内组蛋白H3谷胱甘肽化水平的时间变化趋势Western blot结果经灰度值分析后显示:人支气管上皮细胞组蛋白H3谷胱甘肽化水平随TNF-α刺激在0小时,0.5小时,1小时,6小时内逐渐降低,12小时相有所回升,24小时相再次降低(0.43±0.04,0.36±0.1,0.24±0.09,0.27±0.03,0.35±0.06,0.24±0.1)。(2)上调GSTM5表达对TNF-α介导的16HBE细胞核内组蛋白H3的谷胱甘肽化水平的影响Western blot结果经灰度值分析后显示:TNF-α刺激人支气管上皮细胞12h后,GSTM5过表达组组蛋白H3谷胱甘肽水平变化较阴性对照组及空白组高(1.37±0.06,0.9±0.12,0.84±0.11,P0.05)。四、结论GTSM5可下调TNF-α介导的16HBE细胞Nox1氧化酶基因启动子转录活性,其机制可能与GSTM5在TNF-α诱导核转位后调节组蛋白H3的谷胱甘肽化水平有关。
【学位授予单位】：广东药科大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2018
【分类号】：Q78;R563
【图文】：

图 1-1：质粒电泳图A ladder line2：PGL6-Nox1 质粒 line3：XhoI 酶切 line4：HinII 双酶切 line6：质粒 PCR

图 1-2： pGL6-Nox1 重组质粒测序结果2 GSTM5 对 TNF-α介导的 16HBE 细胞 Nox1 启动子转录活性的作用2.1 上调 GSTM5 表达对 TNF-α介导的 16HBE 细胞 Nox1 启动子转录活性的调作用

P=0.472），见图 1-3。:Nox1 相对荧光素酶活性检测（n=4， x±s）Control TNF-α 合计 F 值 P 值 归变13.932±1.60227.442±3.06120.68±7.56661.125 0.0001 1.97118.674±2.00139.368±2.74429.02±11.282148.489 0.0002 2.115 30.860±3.14951.880±4.10641.370±11.73565.982 0.0001 1.684 27.250±1.98146.657±1.91236.954±10.528198.768 0.0002 1.71522.679±7.22341.337±9.85932.008±12.732F=385.157#P＜0.000#F=3.394*P=0.034* 值 P 值，*交互作用 F 值 P 值

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本文编号：2772061