HMGB1表达水平与COPD大鼠肺动脉平滑肌细胞合成分泌的关系

发布时间：2020-08-04 17:42

【摘要】：慢性阻塞性肺疾病（COPD）是一种重要的慢性呼吸系统疾病，患病人数多，病死率高，已成为全球第四大致死疾病，而我国COPD总患者数高达4300万人，平均每分钟就有2.5人死于COPD。由于其缓慢进行性发展，严重影响患者的劳动能力和生活质量，人们对该病的重视程度已越来越高。COPD患者在急性发作期过后，临床症状虽有所缓解，但其肺功能仍在继续恶化，并且由于自身防御和免疫功能的降低以及外界各种有害因素的影响，经常反复发作，容易继发肺动脉高压，而逐渐产生各种心肺并发症。COPD发病机制复杂，与个人吸烟、环境破坏、空气污染、小气道感染、尘肺等关系密切，尤其PM2.5浓度与COPD息息相关。一项为期6个月的纵向研究表明，室内PM2.5和NO2的浓度升高与COPD患者夜间症状加重和急性发作增加有关。因此，预防COPD的主要措施是避免发病的高危因素、急性加重的诱发因素以及增强机体免疫力。戒烟是预防COPD的简单易行且有效措施。控制职业和环境污染，减少有害气体或有害颗粒的吸人，可减轻气道和肺的异常炎症反应；另有研究报道，如果早期发现和早期干预，且有利于防治COPD。 研究证实，COPD是一种慢性全身性炎症反应性疾病。多种细胞因子及炎症介质如高迁移率族蛋白１（HMGB1）、干扰素γ（IFN-γ）、白介素６（IL-6）等参与炎症反应过程。高迁移率族蛋白系于上世纪60年代最早发现，一种含量丰富的高度保守的非组蛋白核蛋白，广泛分布于哺乳动物细胞，具有晚期促炎作用，因其在凝胶电泳中泳动速度快而得名。高迁移率族蛋白存在于多种细胞的细胞核、细胞质和细胞膜上，通过HMGB box与DNA结合。高迁移率族蛋白包含HMGB1、HMGB2、HMGB3三个相关成员，且85%有同源性，同时HMGB１是在各种因素作用下以主动分泌和被动释放两种方式到达细胞核外。HMGB1是新近发现的晚期炎症细胞因子，具有免疫刺激特性，在COPD等疾病发病过程中具有重要作用。深入研究发现，HMGB1升高与血清中TNF一a、IL一p\lL一6等炎性细胞因子的水平上调有关。当细胞坏死或受损时，在TNF的作用下核内的HMGB１可释放到胞外，引发单核巨噬细胞分泌促炎因子;而促炎因子又可进一步促进HMGB1的分泌，形成正反馈环，或者说网络式级联放大“瀑布”效应。在炎性反应的后期，这种正反馈效应对炎性反应的维持具有重要的作用。1973年Younger和Salvin最先发现γ干扰素，其来自淋巴细胞。其生物学功能主要是免疫调节，诱导多种抗原提呈细胞表达MHC-I/II分子，活化单核、巨噬细胞，分泌IL-1、6、8及TNF-a等。IFN-γ还能活化中性粒细胞等，刺激血管内皮细胞，促进Th1细胞发育和抑制TH2细胞活化与增殖。IFN-γ诱导巨噬细胞可诱导性一氧化氮合酶（iNOS）产生，促进NO的合成， IFN-γ可增加LPS诱导的IL-1转录翻译和分泌。IL-6是TH2细胞因子的典型代表，主要由巨噬细胞、T细胞、B细胞等多种细胞产生，能调节多种细胞的生长与分化，如调节免疫应答、急性期反应及造血功能，并在抗感染免疫反应中起重要作用。IL-6在COPD等多种疾病时有明显改变；IL-6表达失调可引起许多疾病，其临床表现主要为发病时IL-6水平增高。研究显示，IL-6上升的水平与疾病的活动期以及治疗效果都密切相关，因此，对病人体液中IL-6水平的检测可反映患者的病情变化。 COPD的全身炎症反应与肺血管重塑、肺动脉高压密切相关。研究表明，PASMCs不仅是肺血管重塑的主要效应细胞，而且可作为免疫细胞合成分泌相关细胞因子参与炎症发生、发展，促进肺血管重塑。作为主要前炎症细胞因子的HMGB1与COPD患者PASMCs的合成分泌功能之间是否存在调控关系未见相关报道。本实验以COPD模型大鼠原代培养的PASMCs为研究对象，采用分子生物学技术，从细胞水平内探讨HMGB1表达水平与PASMCs合成释放IFN-γ、IL-6等炎性细胞因子的相关性，以期进一步探讨COPD肺血管重塑、肺动脉高压的发病机制，并为进一步预治COPD提供实验依据和干预靶标。 第一部分大鼠远端肺动脉平滑肌细胞原代培养及其生物学特性和功能的研究 目的研究采用组织块贴壁法体外培养原代大鼠远端PASMCs，探讨COPD模型大鼠与正常大鼠远端PASMCs的生物学特性及功能的异同。方法SPF级SD雄性大鼠12只，分2组：(1)对照组：第1、14天经气道内注入同等剂量生理盐水，无香烟烟雾暴露，与模型组同等条件下正常饲养。(2) COPD大鼠模型组：于实验第1、14天经气道内注入脂多糖(LPS)溶液，200μg/次，香烟烟雾暴露1h/d，共8周。模型建立后，组织块贴壁法提取并原代培养各组大鼠远端PASMCs。倒置相差显微镜下观察细胞形态及生长特点；细胞免疫组化、透射电镜鉴定PASMCs；CCK8和细胞荧光流式细胞仪检测各组细胞增殖情况。结果倒置相差显微镜下PASMCs为长梭形或“鱼尾”状，为典型的“峰-谷”样生长，两组细胞形态及生长特点无明显差异；细胞免疫组化、透射电镜鉴定所培养的细胞98%以上为PASMCs；CCK8检测结果示：COPD模型组PASMCs吸光度(A值)高于生理盐水对照组(P＜0.05)；采用CFDASE通过流式细胞仪检测示：COPD模型组PASMCs增殖强于生理盐水对照组(P＜0.05)，即生理盐水对照组PASMCs荧光会增强。结论正常组与COPD模型组原代培养的PASMCs细胞形态学相似，但生物学特性不同，功能亦存在差异。 第二部分HMGB1表达水平与COPD大鼠PASMCs合成分泌IFN-γ、IL-6的关系 目的探讨慢性阻塞性肺疾病(COPD)模型大鼠远端肺动脉平滑肌细胞(PASMCs)高迁移率族蛋白B1(HMGB1)表达水平与其合成分泌干扰素-γ(IFN-γ)、IL-6的相关性及临床意义。方法建立COPD大鼠模型，原代培养PASMCs并鉴定，检测香烟烟雾提取物(CSE)及脂多糖(LPS)诱导下PASMCs合成分泌细胞因子的功能，实验分组：A组(对照组，加入含25%胎牛血清DMEM培养)、B组(另加入5%CSE0.5ml)、C组(另加入100ng/ml LPS0.1ml)、D组(另加入5%CSE0.5ml+100ng/mlLPS0.1ml)，同时A、B、C、D四组另瓶培养，并分别加入1:1000抗HMGB1抗体0.2ml培养设立抗HMGB1抗体干预组（A1、B1、C1、D1）；分别于培养12h、24h、48h、72h后，采用Western blot检测各组PASMCs中HMGB1蛋白表达变化,ELISA检测细胞培养上清液HMGB1、IFN-γ浓度,并进行相关分析。结果(1)光镜下见细胞呈长梭形或“峰、谷”状生长，α－actin免疫组化染色及细胞免疫荧光鉴定为PASMCs；(2) Western blot及ELISA法检测结果显示，培养12h后B、C、D实验组中HMGB1表达水平及细胞上清液HMGB1、IFN-γ、IL-6浓度较A组强(P0.05)，且B、C、D三组呈依次递增(P0.05)；HMGB1蛋白表达水平与IFN-γ、IL-6浓度变化呈正相关(r=0.91、0.83)；加入抗HMGB1抗体干预培养12h后，干预组与对应实验组相比HMGB1、IFN-γ、IL-6都减弱(P0.05)；同组内，于细胞培养12h、24h、48h、72h，Western blot及ELISA法检测结果均无明显差异(P＞0.05)。结论1. COPD模型大鼠远端PASMCs合成分泌HMGB1较生理盐水对照组增加；2.HMGB1表达水平与IFN-γ、IL-6成正相关，抗HMGB1抗体可通过抑制HMGB1，下调IFN-γ、IL-6的表达，提示HMGB1可能成为临床上防治COPD炎症的干预靶点。
【学位授予单位】：桂林医学院
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2014
【分类号】：R563.9
【图文】：

图 4 各组细胞吸光度比较Fig 4 The absorbance of cell in groups荧光流式细胞仪检测各组细胞增殖结果COPD 模型组 PASMCs 增殖强于生理盐水对照组 (P＜0.05)，即生组 PASMCs 荧光会增强(图5、表2)。

图 6 各组细胞增殖比较Fig 6 The proliferation of cell in groups讨 论动脉是由内中外层平滑肌、纤维等许多部分构成，但 PASMCs 是主要结构，具有增殖、分泌等功能。PASMCs 的结构和功能是决学的主要因素之一[44]。目前，对 PASMCs 的结构及其功能的研究外学者的重视。COPD 是一类常见病、多发病，但其发病机制较有待进一步深入广泛研究。研究证实，PASMCs 的异常增殖和 继发肺动脉高压的基本病理生理学改变，并影响患者的预后及生

图 1A 肺动脉平滑肌细胞呈梭形生长(5 天) 图 1B 细胞融合重叠呈“谷与峰”状(10Figure1A PASMCs were spindle growth (5 days) Figure 1B Showed overlapping cell fusion× 100 times "valley and peak" shape (10 days)(二)、细胞免疫组化检测结果用ɑ－SM－actin 进行免疫组化染色后，镜下见大部分胞质内肌动蛋白棕黄色，呈现与细胞长轴平行的丝状物，胞核未见着色，证实为 PASMSc(

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本文编号：2780866