GVHD致肺纤维化作用的机理研究

发布时间：2020-08-05 12:23

【摘要】：研究背景和目的异基因造血干细胞移植(Allogeneic hematopoietic stem cell transplantation, allo-HSCT)现广泛用于治疗多种恶性和非恶性疾病,对某些血液系统疾病甚至是唯一的根治性治疗方法。然而,移植后并发症目前仍然是制约allo-HSCT疗效的最主要因素之一。移植后弥漫性肺损伤发生率为25-60%,且约半数患者因此而死亡。移植后弥漫性肺损伤根据其病因可分为感染性和非感染性肺损伤,根据疾病出现的时间可分为移植早期(100天内)和移植晚期(100天后)肺损伤。非感染性肺损伤主要包括：特发性肺炎综合症(Idiopathic pneumonia syndrome, IPS)、闭塞性细支气管炎(Bronchiolitis obliterans, BO)和闭塞性细支气管炎伴机化性肺炎(Bronchiolitis obliterans organizing pneumonia, BOOP)等。近年来移植后弥漫性非感染性肺损伤逐渐被学者们重视,但其病因及发病机理尚未十分清楚。目前被广泛接受的观点认为移植物抗宿主病(Graft-versus-host disease, GVHD)是导致非感染性肺损伤发生的原因之一：在急性GVHD (aGVHD)致肺损伤中通常表现为IPS,而慢性GVHD (cGVHD)致肺损伤通常表现为BO或BOOP。尽管非感染性肺损伤被认为与GVHD有关,但临床上采用免疫抑制剂治疗疗效并不令人十分满意,尤其是晚期肺损伤患者。有关GVHD肺损伤的机理研究目前主要聚焦在炎症因子和炎症细胞上,而针对于其下游的肺组织实质细胞损伤的病理生理改变机制研究甚少。临床研究发现早期出现过肺损伤的移植患者更容易迁延为晚期肺损伤。不管是移植后早期肺损伤还是晚期肺损伤,其共同的病理学特点是存在肺组织纤维化。在非allo-HSCT患者中,多种原因可引起肺纤维化,包括已知的原因如感染、吸烟、放射线、药物、环境因素、胶原血管病等,也有部分病例无明确病因统称为特发性肺纤维化。肺纤维化发生与发展的病理生理过程十分复杂,目前对其发病机理尚不十分清楚。现广泛接受的观点是：各种致病因子造成肺泡上皮细胞反复损伤,导致肺上皮细胞异常活化,进而激活肺泡内的级联反应,刺激成纤维细胞和成肌纤维细胞增殖和活化并分泌大量细胞外基质(Extracellular matrix, ECM),形成促纤维化的环境。肺纤维化包括肺泡炎,肺损伤和损伤后纤维化修复三个病理阶段,最终病理学改变表现为肺泡壁大量胶原纤维沉积,纤维细胞增生,导致肺泡壁增厚。临床观察发现肺泡上皮细胞破坏与基底膜的损伤是肺间质性纤维化病变早期的重要特点,基质金属蛋白酶与细胞因子、生长因子之间以一个十分复杂的网络联系参与了这一病变过程及纤维化的发生发展。肺纤维化发生过程中,首先发生肺泡的损伤,继而导致肺泡巨噬细胞分泌细胞因子、炎症因子等多种活性成分,刺激成纤维细胞转型增殖和细胞外基质大量沉积,触发肺纤维化。在这些参与肺纤维化的细胞因子中,转化生长因子β(Transforming growth factor β, TGF-β)是目前公认的致纤维化作用最强的细胞因子。TGF-β可通过(1)启动上皮-间质转化(Epithelial to mesenchymal transition, EMT)信号通路使上皮细胞向间质细胞转化,这些转化的间质细胞再进一步分化为成纤维细胞；(2)趋化并促进成纤维细胞增殖分化；(3)刺激成纤维细胞合成与分泌ECM,同时抑制胶原蛋白酶及纤溶酶原激活物以减少ECM降解,造成ECM调控失衡；(4)诱导炎症细胞分泌释放肿瘤坏死因子α (Tumor necrosis factor α, TNF-α),血小板源生长因子(Platelet derived growth factor, PDGF),白细胞介素1 (Interleukin 1, IL-1),白细胞介素8(Interleukin 8, IL-8)等细胞因子促进纤维化发生与发展。相反,干扰素γ(Interferon γ, IFN-γ)具有抗纤维化作用,可通过：(1)下调TGF-β的表达从而抑制成纤维细胞迁移和增殖；(2)直接抑制成纤维细胞和成肌纤维细胞合成和分泌胶原；(3)通过作用于巨噬细胞间接促使成肌纤维细胞凋亡；(4)通过作用于干扰素诱导蛋白10 (Interferon induced protein 10, IP-10)抑制血管生成从而减弱肺纤维化。在正常生理情况上,TGF-β通过促进各种细胞增殖分化和刺激ECM分泌参与损伤组织修复,IFN-γ通过抑制组织内成纤维细胞增殖和胶原合成发挥抗纤维化作用,两者之间相互作用维持肺组织内环境平衡。在病理情况下,细胞/炎症因子刺激肺上皮细胞和巨噬细胞大量分泌TGF-β,导致IFN-γ与TGF-β的相互作用失平衡,这种失平衡激活其下游信号通路,异常活化成纤维细胞和成肌纤维细胞增殖和分泌大量胶原沉积形成纤维病灶。在allo-HSCT患者中,急慢性GVHD引起的不同类型弥漫性非感染性肺损伤的组织病理学共同特点是存在肺纤维化,尤其是肺泡囊和细支气管的纤维化,但其发病机理不清。GVHD引起的弥漫性非感染性肺损伤是否与非移植病人发生的肺纤维化具有共同的病理生理学过程?本研究通过构建aGVHD肺损伤动物模型,探讨allo-HSCT后aGVHD肺损伤肺组织内微环境改变对肺上皮细胞生物学行为的影响和分子机理,阐明aGVHD肺损伤中是否存在EMT,并揭示其调控机制,为治疗allo-HSCT后aGVHD肺损伤和预防其迁延为肺纤维化寻找有效的靶标提供理论依据。研究方法：1) aGVHD肺损伤模型的构建：以BALB/C小鼠作为受鼠,经TBI 8.0Gy全身放疗预处理后接受C57BL/6供鼠10×106脾细胞+5×106骨髓细胞输注诱导aGVHD肺损伤模型,单纯接受供鼠5×106骨髓细胞输注作为对照组,移植后隔日观察移植受鼠生存状况和GVHD临床表现及严重程度,采集小鼠外周血检测嵌合植入情况,同时留取aGVHD组和对照组小鼠肺组织标本进行HE和Masson染色观察肺组织病理结构变化及纤维胶原沉积情况,阐明aGVHD肺组织中是否存在纤维化现象。2)血液、肺泡灌洗液及肺组织中T淋巴细胞亚群分析：采用流式细胞术检测两组小鼠移植后不同时机(7d,14d,21d,28d)血液、肺泡灌洗液及肺组织中CD4、CD8阳性T淋巴细胞亚群变化情况,探讨不同淋巴细胞亚群分布在GVHD肺损伤发生发展过程中的作用。3)血液、肺泡灌洗液及肺组织中细胞因子的表达水平检测：采用ELISA检测移植后不同时机(7d,14d,21d,28d)血液和肺泡灌洗液中细胞因子(TGF-p, IFN-γ, TNF-α)的表达水平；同时采用RT-PCR检测两组肺组织细胞因子mRNA表达水平；比较aGVHD肺损伤小鼠和对照组小鼠移植后不同时机血液、肺泡灌洗液及肺组织中细胞因子表达差异,探讨细胞因子在时间和空间的差异表达对GVHD肺损伤致肺纤维化发生发展的影响。4) EMT信号通路调控的研究：采用免疫荧光标记技术观察移植后发生GVHD肺损伤患者肺组织标本上皮细胞标志蛋白(E-cadherin)和间质细胞标志蛋白(Vimentin)共表达情况；进一步采用RT-PCR和Western blotting检测GVHD组和对照组小鼠移植后不同时机肺组织中E-cadherin和Vimentin的mRNA和蛋白水平表达差异,并同时检测EMT信号通路关键蛋白分子Claudin-1、β-catenin以及调控转录因子Slug的表达差异情况,阐明在GVHD肺损伤中是否存在EMT,并探讨其发生发展的可能机制。统计学处理采用SPSS13.0软件进行统计分析,各组计量资料数据以均数±标准差何±s)描述,两组均数的比较采用独立样本t检验进行统计学分析,以p0.05为差异具有统计学意义。生存分析采用Kaplan-Meier法,组间比较采用log-rank方法,以p0.05为差异具有统计学意义。GraphPad Prism5软件作图。结果1)成功构建C57BL/6→BALB/C aGVHD肺损伤动物模型。分别于移植后第14天、21天、28天采集BALB/C受鼠外周血进行C57BL/6供者标志H2Kb检测,结果显示在移植后第28天两组小鼠的供者标志H2Kb均可达到98%以上,提示供者植入成功。GVHD组小鼠出现明显弓背、活动度减低、毛发纹理紊乱、皮肤裸露及严重腹泻等典型aGVHD表现,且与BMT对照组相比生存状态具有显著性差异(χ2=32.514, P0.001), aGVHD组小鼠移植后体重下降迅速,临床评分高于BMT组小鼠。aGVHD小鼠肺组织病理显示肺组织内弥漫性炎症细胞浸润,肺泡上皮水肿、增生,肺泡间隔增厚等表现,Masson染色可见明显胶原沉积,这些结果提示移植后发生aGVHD的小鼠可出现弥漫性肺损伤改变,且肺组织内存在纤维化现象。2) GVHD肺损伤小鼠在移植早期以CD4+淋巴细胞浸润为主,到移植后期转变为以CD8+淋巴细胞浸润为主。GVHD组小鼠血液中CD4+淋巴细胞在移植后第7d、第14d显著升高(P0.05),后逐渐下降；而两组小鼠血液中CD8+淋巴细胞在移植后各个时间点均无统计学差异(P0.05)。GVHD组小鼠肺泡灌洗液CD4+淋巴细胞在移植后各个时间点均显著升高(P0.05),在移植后第7d达到高峰,后逐渐下降；而CD8+淋巴细胞从第14d开始明显高于对照组(P0.05),并随移植时间逐渐升高至第28d达到高峰。GVHD组小鼠肺组织内CD4+淋巴细胞在移植后第7d、第14d、第21d显著高于BMT对照组(P0.05),但从移植后第7d起呈逐渐下降趋势；而CD8+淋巴细胞在移植后各个时间点均显著高于对照组(P0.05)。3) GVHD小鼠血液、肺泡灌洗液和肺组织中细胞因子(IFN-γ、TNF-α和TGF-β)出现差异性表达。GVHD组小鼠血液中IFN-y表达水平在移植第28d显著低于BMT对照组(P0.05); TNF-α表达水平在移植后第7d、第14d、第21d显著高于对照组(P0.05),但从移植后第7d起呈逐渐下降趋势；两组小鼠移植后各个时间点血液TGF-β表达水平均无显著性差异(P0.05)。GVHD组小鼠肺泡灌洗液中IFN-γ表达水平在移植后第7d、第14d显著升高(P0.05),随后逐渐下降;移植后GVHD小鼠肺泡灌洗液中TNF-α表达水平逐渐升高,在移植第14d达高峰,后逐渐降低；TGF-β水平呈现逐渐上升趋势,在移植后第14d、21d、28d显著高于BMT对照组(P0.05)。GVHD组小鼠肺组织中IFN-y表达水平在移植后第7d、第14d明显升高(P0.05),而在移植后第28d反而低于对照组(P0.05); TNF-α表达水平在移植后第7d升高,后逐渐降低,在移植后第21d、28d明显低于对照组(P0.05); GVHD组小鼠肺组织内TGF-β表达水平与肺泡灌洗液中的变化趋势一致,在移植后第14d、21d、28d显著高于BMT对照组(P0.05)。4) GVHD肺损伤组织中存在EMT。我们观察到移植后发生GVHD肺损伤患者肺组织中可见E-Cadherin和Vimentin共表达于肺上皮细胞表面；进一步在动物模型中检测到GVHD组小鼠肺组织上皮细胞标志E-cadherin的蛋白表达水平显著低于BMT组,而间质细胞标志Vimentin的蛋白表达水平显著升高,且这种变化随着移植时间的延续而差异更加明显。与对照组相比较,GVHD组小鼠肺组织中的EMT信号通路关键蛋白分子β-catenin、Claudin-1和转录因子Slug的表达水平均明显升高。这些结果提示在GVHD肺损伤发生发展过程中存在EMT。结论1)构建了稳定的C57BL/6→BALB/C aGVHD肺损伤动物模型,并通过观察aGVHD小鼠肺组织病理改变和胶原沉积情况,证实了aGVHD小鼠肺组织中存在纤维化现象。2)aGVHD肺损伤小鼠在移植早期以CD4浸润为主,到移植后期转变为以CD8浸润为主,提示在aGVHD肺损伤过程中出现CD4→CD8淋巴细胞飘移。3) aGVHD小鼠肺组织内细胞因子的失平衡可能为启动GVHD肺损伤致肺纤维化发生发展的“开关”。4)在GVHD肺损伤过程中存在EMT,肺组织内微环境的改变可导致肺上皮细胞发生EMT使上皮细胞向间质细胞转化,是早期肺损伤迁延为晚期肺纤维化的原因之一。
【学位授予单位】：南方医科大学
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2015
【分类号】：R563
【图文】：

嵌合,小鼠,骨髓细胞,毛发

移植后隔日监测小鼠体重、毛发、姿势、腹泻、生存等变化，每批小鼠ＧＶＨＤ逡逑组和ＢＭＴ组各为６只不同的小鼠，实验重复３次。ＧＶＨＤ组为ｌＯｘｌＯ６脾细胞逡逑ＷｘｌＯ６骨髓细胞／只，ＢＭＴ组为５Ｘ１０６骨髓细胞／只。图１－２邋Ａ和Ｂ小鼠可见明逡逑显弓背、活动度减低、毛发纹理奈乱、皮肤裸露及严重腹泻等典型ａＧＶＨＤ表逡逑现，而对照组Ｃ和Ｄ小鼠无上述表现。逡逑１５逡逑

临床表现,小鼠

图１－２邋ＧＶＨＤ和ＢＭＴ小鼠移植后临床表现逡逑Ｆｉｇｕｒｅ邋１－２邋Ｔｈｅ邋ｃｌｉｎｉｃａｌ邋ｍａｎｉｆｅｓｔａｔｉｏｎｓ邋ｏｆ邋ＧＶＨＤ邋ａｎｄ邋ＢＭＴ邋ｍｉｃｅ邋ｐｏｓｔ－ＨＳＣＴ逡逑图１－３邋Ａ为移植后两组受鼠的生存状况，Ｂ为移植后两细受鼠的体重变化，逡逑Ｃ为移植后两组受鼠的临床ＧＶＨＤ评分。如图所示，Ａ：邋ＧＶＨＤ组小鼠在移植逡逑后２周开始出现死亡，在移植后３－４周法到高峰，而ＢＭＴ组小鼠在移植后长期逡逑生存，至移植后３０天均没有出现死亡。经Ｋａｐｌａｎ－Ｍｅｉｅｒ生存分析法统计分析，逡逑两组间比较采用ｌｏｇ－ｒａｎｋ方法，两组生存时间差异具有显著统计学意义逡逑（义２＝３２．５１４，户＜０．００１）。Ｂ：邋ＧＶＨＤ小鼠移植后１周内出现体重迅速下降，２－３逡逑周处于相对平稳状态，第４周开始又出现体重下降的趋势：而ＢＭＴ对照组小逡逑鼠仅在移植前３天出现体重轻度下降，后维持在稳定水平。Ｃ：邋ＧＶＨＤ组小鼠的逡逑ａＧＶＨＤ临床评分在移植后１周内评分波动较大

骨髓细胞,小鼠,生存状况,体重变化

ＧＶＨＤ逦ＢＭＴ逡逑图１－２邋ＧＶＨＤ和ＢＭＴ小鼠移植后临床表现逡逑Ｆｉｇｕｒｅ邋１－２邋Ｔｈｅ邋ｃｌｉｎｉｃａｌ邋ｍａｎｉｆｅｓｔａｔｉｏｎｓ邋ｏｆ邋ＧＶＨＤ邋ａｎｄ邋ＢＭＴ邋ｍｉｃｅ邋ｐｏｓｔ－ＨＳＣＴ逡逑图１－３邋Ａ为移植后两组受鼠的生存状况，Ｂ为移植后两细受鼠的体重变化，逡逑Ｃ为移植后两组受鼠的临床ＧＶＨＤ评分。如图所示，Ａ：邋ＧＶＨＤ组小鼠在移植逡逑后２周开始出现死亡，在移植后３－４周法到高峰，而ＢＭＴ组小鼠在移植后长期逡逑生存，至移植后３０天均没有出现死亡。经Ｋａｐｌａｎ－Ｍｅｉｅｒ生存分析法统计分析，逡逑两组间比较采用ｌｏｇ－ｒａｎｋ方法，两组生存时间差异具有显著统计学意义逡逑（义２＝３２．５１４，户＜０．００１）。Ｂ：邋ＧＶＨＤ小鼠移植后１周内出现体重迅速下降，２－３逡逑周处于相对平稳状态，第４周开始又出现体重下降的趋势：而ＢＭＴ对照组小逡逑鼠仅在移植前３天出现体重轻度下降

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