自噬抑制剂缓解大气细颗粒物诱导的急性气道炎症

发布时间：2020-08-09 14:27

【摘要】：背景:大气细颗粒物(PM)是由多种成分组成的复杂混合物,包括酸,有机化学物,金属,土壤或灰尘颗粒。它的吸入会导致呼吸道症状的恶化,药物使用频繁,肺功能下降,气道损伤以及死亡率的增加。然而目前仍未有药物可以保护PM介导的气道损伤。已有研究发现细胞自噬在PM介导的气道损伤中起关键作用。细胞自噬是PM诱导气道炎症及黏液高分泌所必需的并且是通过NF-κB以及AP-1(activator protein 1)通路起作用。因此,我们认为自噬抑制剂(Spautin-1以及3-Methyladenine,3-MA)可能是治疗PM诱导的气道损伤的有效方法,可能为PM相关的气道损伤提供新的预防和/或保护途径。目的:本课题拟探讨自噬抑制剂(Spautin-1以及3-MA)是否能抑制PM诱导的急性气道炎症,并探索可能的机制。方法:在PM干预过的人体气道上皮细胞HBE(human bronchial epithelial cells)中分别加入自噬抑制剂(Spautin-1和3-MA),利用蛋白质印迹法(Western Blot,WB)检测PM诱导的细胞自噬并检测NF-κB通路相关蛋。同时利用Q-PCR(quantitative real-time polymerase chain reaction)检测分别干预自噬抑制剂(Spautin-1 或3-MA)以及PM后HBE炎症因子的表达。在体内研究中,将6-8周雄性C57BL/6小鼠随机分为4组,第一组为生理盐水对照组(NS组),第二组为单纯给药组(Spautin-1或3-MA),第三组为单纯PM干预组,第四组为PM+给药组(PM+Spautin-1或PM+3-MA)。于PM最后一次干预24小时后处死小鼠,予小鼠肺泡灌洗3次,取小鼠肺泡灌洗液用光学显微镜观察炎症细胞总数及甩片染色后记录中性粒细胞比例及绝对值,肺组织用Q-PCR及ELISA检测炎症因子的表达,肺组织病理HE染色观察气道周围炎症浸润的情况。结果:(1)体外实验证明在同时加入自噬抑制剂(Spautin-1或3-MA)和PM干预后的HBE细胞,炎症因子IL-6,IL-8的表达比单纯干预PM的HBE细胞要低,并且NF-κB通路相关蛋白p65和p-p65表达也降低。(2)体内实验证明自噬抑制剂(Spautin-1和3-MA)能缓解PM滴注后小鼠气道炎症,肺泡灌洗液中炎症细胞总数及中性粒细胞比例及绝对值明显减少,肺组织炎症因子显著降低,气道周围炎症浸润明显缓解。结论:细胞自噬抑制剂(Spautin-1和3-MA)可以通过NF-κB通路有效缓解大气颗粒物(PM)诱导的气道炎症。可能为PM相关的气道损伤提供新的保护方法。
【学位授予单位】：浙江大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2018
【分类号】：X513;R56
【图文】：

我们用不同浓度梯度的ＰＭ干预ＨＢＥ细胞，在干预后２４ｈ收样，用ＷＢ检测细逡逑胞自噬ｍａｒｋｅｒＬＣ３以及ｐ６２的表达。我们发现ＬＣ３随ＰＭ干预浓度的增加而表达逡逑增加，而ｐ６２随ＰＭ干预浓度的增加而表达降低（图３．１），综上所述说明了随着ＰＭ逡逑干预浓度的增加，细胞自噬水平增加。另外，我们用同样浓度的ＰＭ干预ＨＢＥ细逡逑胞，发现细胞自噬水平随着干预时间的增加而增加（图３．２）。于此同时，透射电镜逡逑观察ＰＭ（１０（Ｖｇ／只）气道滴注２天后小鼠支气管的气道上皮细胞，发现相较于生理逡逑盐水组（ＮＳ组），自噬小体的数量明显增加（图３．３）。因此，以上结果提示ＰＭ能逡逑诱导人气道上皮ＨＢＥ细胞以及小鼠气道上皮细胞自噬水平的增加。逡逑Ｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｉｏｎ邋０逦２５逦５０逦１００逡逑（（＿ｔｇ／ｍｌ）逦逦逡逑ＬＣ３Ｉ逦＾————逡逑ＬＣ３１１逦一—逦—逦逦逦丨丨．．Ｔ逡逑逦邋…１．１．１．．．．．１邋＂邋．．邋＋邋？邋邋逦＿邋｜邋邋逡逑ｐ６２逦丨}0栜逡逑Ｐ－ａｃｔｉｎ逦逦邋＿丨爹邋＿＿＿＿＿＿川丨丨一邋＿丨１邋－爹逡逑图３．１细胞自噬随着ＰＭ干预浓度的增加而增加。用卩叼（０，２５，５０，１００呢／0１１）干预逡逑ＨＢＥ细胞２４ｈ，提取细胞总蛋白，Ｗｅｓｔｅｒｎ邋Ｂｌｏｔ检测ＬＣ３以及ｐ６２的表达。以（３－ａｃｔｉｎ逡逑为内参。逡逑２１逡逑

逦１１５００＊逡逑ｒ邋１逡逑图３．３体内实验中，气道滴注ＰＭ后小鼠气道上皮细胞中自噬小体的数量明显增加。逡逑ＰＭ气道滴注２天后取小鼠气管处理后，透射电镜观察小鼠支气管气道上皮细胞，逡逑发现相较于ＮＳ组，ＰＭ实验组自噬小体的数量明显增加。逡逑２２逡逑

－逡逑Ｐ－ａｃｔｉｎ逡逑图３．２细胞自噬随着ＰＭ干预时间的增加而增加。用ＰＭ（１００ｐｇ／ｍｌ）干预ＨＢＥ细胞逡逑（０，８，１６，２４ｈ），提取细胞总蛋白，ＷｅｓｔｅｍＢｌｏｔ检测ＬＣ３以及ｐ６２的表达。以ｐ－ａｃｔｍ逡逑为内参。逡逑８３００＊逦１１５００＊逡逑ｒ邋１逡逑图３．３体内实验中，气道滴注ＰＭ后小鼠气道上皮细胞中自噬小体的数量明显增加。逡逑ＰＭ气道滴注２天后取小鼠气管处理后，透射电镜观察小鼠支气管气道上皮细胞，逡逑发现相较于ＮＳ组，ＰＭ实验组自噬小体的数量明显增加。逡逑２２逡逑

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