重组β-防御素-2对大鼠急性肺损伤的保护作用研究

发布时间：2020-08-13 17:01

【摘要】： 研究背景与目的防御素是20世纪90年代初发现的广泛分布于植物、昆虫、两栖动物、鸟类以及哺乳动物中的一类小分子阳离子抗菌肽，分子量约4kD至5kD，它们具有广泛的抗菌谱，参与了机体的天然免疫和获得性免疫，对免疫细胞具有趋化作用。根据空间结构的不同，分为α-和β-防御素两个家族。由于防御素独特的结构、作用方式及其免疫调节作用，防御素家族已经引起国际学术界的广泛关注，它们在体内的表达方式、生理功能、作用机理、协同作用及家族新成员的相继发现等均已成为该领域的研究热点。然而，目前关于防御素的生物学功能的研究大部分在体外进行，这些研究只有转化为动物模型的体内研究后，才能更为准确的反映防御素在人类疾病发生、发展中的作用。 β-防御素-2是第一个被发现的在表皮和肺上皮细胞中呈诱导型表达的抗菌肽，资料表明其表达水平异常或生物活性受损与某些呼吸系统疾病，如先天性肺囊性纤维化及全身性感染患者肺部感染的发生发展密切相关。这提示它可能通过对病原微生物的直接杀伤或是对炎症过程的调节而发挥作用。然而迄今为止，β-防御素-2在肺损伤发生发展中的作用机制仍未明了。 由于肺的解剖位置的特殊性，肺在炎症反应过程中的重要作用，以及防御素在肺组织的丰富表达，肺成为研究防御素作用的最重要的脏器和模型。急性肺损伤(acute lung injury，ALI)是临床上常见的呼吸系统功能失常，感染、脓毒症、创伤都可导致ALI的发生，其严重形式即急性呼吸窘迫综合征(acute respiratory distress syndrome，ARDS)死亡率高达30％-50％。随着机械通气的运用、监护及营养条件的改善，ARDS患者的死亡率有所下降，但仍是危重病患者一个主要的死亡原因，尤其是脓毒症所致的ARDS，如何促进和改善ALI/ARDS的预后是临床上的研究热点。 本文拟通过转基因的方法，实现重组β-防御素-2在肺部的表达，进行相关肺损伤保护作用的研究。如何采用合适的表达系统，在高表达的同时充分保持抗菌肽的生物学活性已成为研究的关键。腺病毒载体作为广泛应用的表达系统之一，能有效感染哺乳动物细胞，具有高效传递和表达基因的能力，利用腺病毒载体系统在哺乳动物细胞内进行抗菌肽的表达目前尚未见报道。 本文将以人β-防御素-2(hBD2)的同源体——大鼠β-防御素-2(rBD2)为研究对象，分为①构建携带rBD-2基因的重组腺病毒表达载体、②重组rBD2对绿脓杆菌感染致急性肺损伤的保护作用研究、③重组rBD2对脓毒症所致急性肺损伤的保护作用研究三个部分，探讨应用腺病毒载体系统获得重组rBD2在大鼠肺部表达的可行性、了解重组rBD2在绿脓杆菌感染及脓毒症所致急性肺损伤、肺功能障碍发生发展中的作用，以图阐明防御素在体内的生理功能及其作用机理，也可为研究防御素在相关疾病中的作用提供理论依据。 第一部分重组β-防御素-2基因腺病毒表达载体的构建与真核表达 研究目的探讨重组腺病毒载体在真核细胞中稳定表达阳离子抗菌肽——β-防御素-2的可行性。 研究方法采用RT-PCR方法扩增得到大鼠β-防御素-2(rBD2)基因片段，定向插入到腺病毒穿梭质粒pShuttle-CMV中，重组质粒pShuttle-CMV-rBD2转化E．coli BJ5183-AD-1后，与腺病毒基因组质粒pAdEasy-1发生同源重组，重组质粒pAdEasy-rBD2转染293细胞进行腺病毒表达载体的包装。将包装成功的腺病毒Ad-rBD2感染COS-7细胞，并建立SD大鼠腺病毒感染模型，进行β-防御素-2多肽的体外和体内表达，采用Western blot与免疫组化方法检测其表达。同法构建对照腺病毒载体Ad-LacZ。 结果构建的重组腺病毒表达载体含有大鼠β-防御素-2基因，滴度达到10~9PFU/ml，Western blot与免疫组化方法分别检测到β-防御素-2在体外、体内的表达。 结论利用腺病毒表达载体系统进行β-防御素-2的转基因研究具有可行性，构建的重组腺病毒载体在体外、体内都能够表达目标蛋白。 第二部分重组β-防御素-2对大鼠呼吸道绿脓杆菌感染急性肺损伤的保护作用 研究目的探讨重组β-防御素-2对大鼠呼吸道绿脓杆菌感染急性肺损伤的保护作用。 研究方法清洁级健康SD雄性大鼠12只，随机分为两组，Ad-rBD2组(实验组)及Ad-LacZ组(对照组)各6只。均予以氯胺酮7mg/100g腹腔注射麻醉后，行气管插管，分别气道滴注Ad-rBD2(10~7PFU)及Ad-LacZ(10~7PFU)。48小时后全部大鼠经气道滴注200μl的6×10~8CFU/ml(菌落数/毫升)绿脓杆菌ATCC27853，建立绿脓杆菌感染后肺损伤模型。气道给予绿脓杆菌24小时后处死大鼠，采集肺泡灌洗液行肺细菌清除率测定和白细胞计数；取肺组织观察其病理变化。 结果与对照组相比，Ad-rBD2组肺泡灌洗液白细胞计数显著降低(P＜0.05)，细菌清除率增高(P＜0.05)，肺组织中性粒细胞和单核细胞渗出减少、肺泡结构仍保持完整、间质水肿减轻。 结论重组β-防御素-2具有体内杀菌活性，对呼吸道绿脓杆菌感染大鼠肺损伤的发生、发展具有保护作用。 第三部分重组β-防御素-2对大鼠脓毒症急性肺损伤的保护作用 研究目的探讨重组β-防御素-2对大鼠脓毒症致急性肺损伤的保护作用以及对预后的影响。 研究方法SD大鼠84只随机分为两组，Ad-rBD2组(实验组)及Ad-LacZ组(对照组)各42只。均予以氯胺酮7mg/100g腹腔注射麻醉后，行气管插管，分别气道滴注Ad-rBD2(10~7 PFU)及Ad-LacZ(10~7 PFU)。48h后行盲肠结扎穿孔，建立脓毒症模型。于模型完成后0h，12h，24h，36h，72h处死大鼠(每个时间点n=12，实验组、对照组各6只)，取肺及腹腔灌洗液，行灌洗液细菌计数、肺组织常规病理切片观察、肺组织细胞凋亡电镜及TUNEL法检测、肺组织ICAM-1免疫组化检测以及大鼠生存率分析(n=24，Ad-LacZ组、Ad-rBD2组各12只)。 结果与Ad-LacZ组比较，Ad-rBD2组肺组织炎性细胞浸润及间质水肿程度减轻，细胞凋亡减少(P＜0.05)、ICAM-1表达下降(P＜0.05)。两组腹腔灌洗液细菌计数无明显差别(P＞0.05)，Ad-rBD2组生存率明显提高(P＜0.05)。 结论重组β-防御素-2对脓毒症所致的大鼠急性肺损伤具有保护作用，可有效改善急性肺损伤的预后；其作用机制与其对炎症因子ICAM-1、肺组织细胞凋亡的调节相关。
【学位授予单位】：浙江大学
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2007
【分类号】：R563.8
【图文】：

5、质粒:pGEM一T载体:promega公司;p一Shurtle一CM、r质粒(PsC):穿梭载体，7.4kb，含有CMV启动子及卡那霉素抗性的质粒，能容受6.6kb的外源基因，购自美国stratagene公司(见图1〔1]);pAdEasy一1质粒:为腺病毒5型骨架质粒，33.5kb，具有氨节青霉素抗性，含有pBR322复制起始子、重组左臂、重组右臂。El，E3基因缺失，购自美国stratagene公司;p一shuttle一cMV-LacZ质粒(PSC一LacZ):为外源基因重组腺病毒产物的对照质粒，10.6kb，购自美国stratagene公司;转化对照质粒:为细菌BJ5183一Ad一1作电转化效率的对照，购自美国stratagene公司;pUC18对照质粒:为高拷贝质粒

的大鼠肺组织免疫组化检测显示rBDZ表达于呼吸道肺泡上皮细胞胞浆及胞膜，且以后者为主，而空白组及对照腺病毒Ad.LacZ感染的大鼠肺组织无阳性表达(图7)。7、大鼠肺组织常规病理检测:肺组织常规病理切片显示肺泡间隔无增宽，无明显炎症细胞浸润，肺泡腔无渗出，炎症病理改变不明显(图8)。国6盆组月翻嘴璐染。‘，细脚脚社编r刊眼农达的 we.terUbl砚一检侧别如叮e‘D吐搜沮.ot卜山介”目刀.2e冲r.目颇加山.翔p扮.目七.t侧比口d助Odor、V侧吐臼公b加‘L翻el、3:10·份20.倒dLanoZ，4:l小份20.foldco沉。劝门肠dsup周团旧加址介。mco6·7如触扭月初比Ad，LacZc翻c.trat曰翎p侧比Ia恤以众伪 nc.一i加浇改时州比Ad，旧DZ

性表达(图7)。7、大鼠肺组织常规病理检测:肺组织常规病理切片显示肺泡间隔无增宽，无明显炎症细胞浸润，肺泡腔无渗出，炎症病理改变不明显(图8)。国6盆组月翻嘴璐染。‘，细脚脚社编r刊眼农达的 we.terUbl砚一检侧别如叮e‘D吐搜沮.ot卜山介”目刀.2e冲r.目颇加山.翔p扮.目七.t侧比口d助Odor、V侧吐臼公b加‘L翻el、3:10·份20.倒dLanoZ，4:l小份20.foldco沉。劝门肠dsup周团旧加址介。mco6·7如触扭月初比Ad，LacZc翻c.trat曰翎p侧比Ia恤以众伪 nc.一i加浇改时州比Ad，旧DZ

【参考文献】

相关期刊论文 前1条

1 方向明,徐笑益,陈齐兴,舒强;急性肺损伤对肺组织β-防御素-2基因表达的影响[J];中华麻醉学杂志;2002年05期

本文编号：2792267