慢性阻塞性肺疾病上皮细胞中HIF-1α与MUC5AC表达及正反馈机制

发布时间：2020-08-18 10:50

【摘要】：背景慢性阻塞性肺疾病(chronic obstructive pulmonary disease,COPD)是一种常见、多发的慢性呼吸系统疾病,且致残率和死亡率较高。《慢性阻塞性肺疾病全球倡议》将慢性阻塞性肺疾病定义为一种可预防、可治疗的疾病,其主要特征为持续存在的且不完全可逆的进行性气流受限。气道粘液高分泌是很多慢性气道炎症疾病加重与进展的重要因素,MUC5AC是其中最重要的分泌型粘蛋白,研究显示它的分泌机制与蛋白偶联受体、酪氨酸激酶受体(tyrosine protein kinase,TPK)、非酪氨酸激酶受体等介导的多个信号途径有关,其中PI3K介导的信号通路在MUC5AC的分泌过程中起着重要作用。缺氧诱导因子-1(hypoxia inducible factor-1,HIF-1)是一个介导机体缺氧反应的重要转录因子,且在低氧应答反应中有着关键的作用。研究表明,HIF-1α不仅对于调节细胞、机体的氧平衡起重要作用,HIF-1α蛋白的稳定性在调控HIF-1的表达中起关键限速作用,还可诱导活化与缺氧适应、炎症发展等相关的近100多种靶基因的表达,进而发挥广泛的效应。有研究表明,HIF-1α与慢性阻塞性肺疾病的肺部炎症反应及肺血管的重塑有关,HIF-1α通过上调一氧化氮合酶基因参与了肺血管的重塑,从而参与了慢阻肺的发病过程。近几年,HIF-1α在炎症中的作用越来越引起重视,过去的研究证实:HIF-1α通过PI3K/AKT、MAPK通路等调控多种炎症因子,影响炎症反应。而PI3K/AKT通路激活能够促进MUC5AC的表达的研究较少,因此本研究尝试探讨在慢性阻塞性肺疾病中HIF-1a对粘蛋白MUC5AC表达的调控机制,及其对COPD疾病发展过程的影响。目的研究HIF-1α和MUC5AC在慢性阻塞性肺疾病患者中表达水平,探讨HIF-1α对MUC5AC表达的调控机制及对COPD病程进展的影响。方法本研究收集71例肺泡灌洗液标本进行初步研究,其中59例为符合标准的COPD患者样本,12例为因其他疾病在我院住院的肺功能正常者。Realtime PCR及Western blot检测肺泡灌洗液中上皮细胞中HIF-1α、TGF-β及MUC5AC的mRNA和蛋白的表达水平,并进一步分析HIF-1α与MUC5AC表达的相关性。以人胚肺上皮细胞为模型细胞,分别采用HIF-1α的激动剂CoCl2和PI3K的激动剂740Y-P进行处理,Realtime PCR和Western blot法检测处理后细胞HIF-1α、EGFR、AKT及MUC5AC的mRNA和蛋白的表达水平,进一步探讨HIF-1α和PI3K对MUC5AC的调控机制。结果1.与对照组相比,COPD组HIF-1α、TGF-β、MUC5AC的mRNA和蛋白表达水平均显著高于对照组,且具有统计学意义(P0.05);HIF-1α与MUC5AC的mRNA表达水平呈正相关性。2.CoCl2成功诱导人胚肺上皮细胞形成缺氧模型后,Realtime PCR和Western blot检测结果发现HIF-1α、EGFR、AKT及MUC5AC均表达升高,均具有统计学意义(P0.05);PI3K的激动剂740Y-P处理人胚肺上皮细胞后,Realtime PCR和Western blot检测结果发现激活PI3K后AKT的磷酸化水平增加,且MUC5AC的mRNA及蛋白水平均有显著上升。而HIF-1α及EGFR的mRNA及蛋白水平也发生不同程度的上调。结论1.COPD组HIF-1α、TGF-β、MUC5AC的mRNA和蛋白水平均高于对照组,HIF-1α的mRNA表达水平与MUC5AC的mRNA表达水平呈正相关。HIF-1α、TGF-β与MUC5AC均参与慢性阻塞性肺疾病病理过程。2.CoCl2诱导人胚肺细胞NCI-H1563缺氧导致HIF-1α高表达,从而上调EGFR激活PI3K致使MUC5AC表达升高;PI3K激动剂740Y-P可以通过激活EGFR-PI3K-AKT信号通路从而使MUC5AC表达升高,同时反馈性地上调HIF-1α的表达。提示HIF-1α和MUC5AC之间存在正反馈调节作用,可协同促进炎症反应和粘蛋白的分泌。
【学位授予单位】：郑州大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2017
【分类号】：R563.9
【图文】：

对照组,统计学意义,上皮细胞,细胞

第二部分：HIF-1α与 MUC5AC 在 COPD 中的正反馈机制结果不同处理组细胞 HIF-1α、EGFR 和 MUC5AC 的荧光定量结果采用 125μM CoCl2处理人胚肺上皮细胞造成的低氧应答细胞模型，与未的对照组细胞相比 HIF-1α mRNA 表达量上调为 3.97±0.2787，EGFR mRNA量上调为 2.247±0.3253，MUC5AC mRNA 表达量上调为 3.14±0.1058，且差具有显著的统计学意义（P＜0.001），见图 2、表 3。采用 20μM 740Y-P 激活 EGFR/PI3K/AKT 通路的人胚肺上皮细胞，与未的对照组细胞相比 HIF-1α mRNA 表达量上调为 2.03±0.1353，EGFR mRNA量上调为 1.48±0.28，MUC5AC mRNA 表达量上调为 2.383±0.3172，且差异有显著的统计学意义（P＜0.001），见图 2、表 3。

蛋白表达,对照组,低氧,磷酸化

Control 1.143±0.1115 1.21±0.2254 1.16±0.2563125μM CoCl23.97±0.2787*** 2.247±0.3253*** 3.14±0.1058***740Y-P 2.03±0.1353*** 1.48±0.28*** 2.383±0.3172***注：与对照组相比，*表示 P＜0.05；**表示 P＜0.01；***表示 P＜0.0012.2 不同处理组细胞 HIF-1α、EGFR、MUC5AC 和 p-AKT 的蛋白免疫印迹结果Western blot 结果显示在 CoCl2诱导的低氧应答模型中，与未处理的对照组相比，HIF-1α、EGFR、MUC5AC 及 p-AKT 的蛋白表达水平均有显著上调，且具有统计学意义（P＜0.05）；AKT 磷酸化水平增加意味着低氧应答机制过表达HIF-1α激活 EGFR/PI3K/AKT 通路，见图 3。采用 20μM 740Y-P 激活 EGFR/PI3K/AKT 通路的人胚肺上皮细胞，与未处理的对照组细胞相比，AKT 磷酸化水平显著上升，且 MUC5AC 的表达水平亦有显著上调，且具有统计学差异（P＜0.05）；相较于对照组细胞，740Y-P 处理同样导致了 HIF-1α及 EGFR 蛋白水平的上调，见图 3。

示意图,示意图,慢阻肺,致病机理

图 4 HIF-1α促进 COPD 发生示意图述，本研究我们首次提出 HIF-1α的高表达是由 COPD 激 HIF-1α又通过激活 EGFR/PI3K/AKT 信号通路过表达的过表达进一步加剧了慢阻肺的病理状态。同/AKT 通路可以进一步反馈刺激 HIF-1α上调，从而形成恶慢阻肺的致病机理以及相关致病因子之间的关系提供了理

【参考文献】