胸导管淋巴液对重症急性胰腺炎并发肺损伤影响的实验研究

发布时间：2020-08-22 06:09

【摘要】： 目的:重症急性胰腺炎(Severe Acute Pancreatitis, SAP)临床过程凶险,其病死率高。目前研究证实,SAP并发急性肺损伤(acute lung injury,ALI)高达60～70%,终致并发急性呼吸窘迫综合征(acute respiratory distress syndrome ,ARDS),而成为SAP的主要死亡原因之一,SAP病死患者中65%以上与急性呼吸窘迫综合症(ARDS)有关,而ARDS是急性肺损伤的一个终末结局。因此,明确SAP时ALI的发病机制,早期预防和治疗ALI对降低SAP的死亡率及改善疾病的预后具有重要意义。 SAP时ALI是机体过度炎症反应导致肺血管内皮细胞和肺泡上皮细胞广泛破坏的结果,而中性粒细胞(polymorphonuclear neutrophils, PMN)能触发和放大炎症反应,在炎症反应中起着关键作用,是炎性反应的重要标志。有研究结果显示SAP时,PMN在肺内粘附聚集,导致肺血管内皮细胞、肺泡上皮细胞广泛损伤,致通透性增加、肺水肿及微血栓形成,进而发展成ALI。PMN在肺内聚集和激活是SAP时ALI发病的最初环节,如果能采取干预PMN在肺内的聚集激活,就能早期预防ALI。但是关于SAP时PMN在肺内聚集和激活的机制并不十分清楚,仍有待进一步研究。目前,肠系膜-胸导管淋巴液在重度烧伤、感染中毒性休克等中的作用得到重视,并认为其可以介导严重感染/创伤等引起的肺脏损伤,并进而导致肺和全身的炎症反应。临床及动物实验发现各种原因引起的多器官功能障碍综合症(multiple organs dysfunction syndromes, MODS)常常首先出现ARDS,而肺是首个接纳肠系膜淋巴液的器官,肠系膜淋巴液可能起着介导肺损伤的作用;又有研究显示了休克后收集到的肠系膜淋巴液能损伤或致内皮细胞死亡,增加内皮细胞的渗透性,结扎肠系膜淋巴管能减轻失血性休克后或烧伤后肺损害。这些研究都提示肠系膜淋巴液含有能够介导全身炎症反应时肺损伤的物质。而且在创伤性休克的动物模型或病人的门静脉血的研究中,并没有发现细菌或毒素。同时,休克时门静脉血浆对于血管内皮细胞的损伤作用很轻。这些研究表明经肠道微血管回流的门静脉途径在休克致器官损伤的发病学意义有一定的局限性。Louis报道失血性休克所致的肺损伤和内皮细胞通透性增高是由肠道有害物质经淋巴液而非经门静脉血液所引起的。据此,我们推测这种作用在类似烧伤和严重感染的SAP中可能也存在,并且有可能通过诱导PMN在肺脏聚集和激活来介导。本研究应用SD大鼠建立颈部胸导管引流模型,并在此基础上制备SAP合并ALI模型,观察肺脏病理变化,检测血气分析变化,从而了解胸导管结扎/引流对ALI的影响;并检测胸导管淋巴液中抗炎和促炎因子、胰酶、内毒素的含量变化,以及其对动脉血中PMN功能的影响预后,观察SAP继发ALI时上述指标的变化。旨在探讨SAP时胸导管淋巴液的成分变化在激活肺脏中PMN、介导SAP时ALI发生中的作用,以及可行的干预途径,进一步阐明SAP合并ALI的发病机制,为临床治疗提供新的思路、途径及理论和实验依据。方法: 第一部分:大鼠颈部胸导管引流动物模型的建立选用成年清洁级雄性SD大鼠60只。随机将大鼠分为3组,每组20只:第1组:颈部胸导管直接组,第2组:颈部胸导管间接组,第3组:腹部胸导管组。在戊巴比妥钠麻醉并固定后,应用显微手术器械分别解剖颈部胸导管、左颈干、腹部胸导管,应用24G留置针分别穿刺保留颈部胸导管、左颈干、腹部胸导管,引流淋巴液。记录三种胸导管淋巴液引流模型之间淋巴流量、制模成功情况。第二部分:胸导管结扎/引流对重症急性胰腺炎并发肺损伤早期干预及动脉中性粒细胞功能变化的实验研究选取健康雄性SD大鼠96只,随机分为12组,每组8只,分别为颈部假手术组+腹部假手术2小时组(SO2h)、颈部假手术组+腹部假手术6小时组(SO6h)、颈部假手术组+腹部假手术12小时组(SO12h);颈部假手术组+SAP2小时组(SAP2h)、颈部假手术组+SAP6小时组(SAP6h)、颈部假手术组+SAP12小时组(SAP12h);颈部胸导管结扎+SAP2小时组(LC2h)、颈部胸导管结扎+SAP6小时组(LC6h)、颈部胸导管结扎+SAP12小时组(LC12h);颈部胸导管引流+SAP2小时组(DC2h)、颈部胸导管引流+SAP6小时组(DC6h)、颈部胸导管引流+SAP12小时组(DC12h)。按分组要求制备颈部假手术组+腹部假手术组(SOA)、颈部假手术组+SAP组(SAP)、颈部胸导管结扎+SAP组(LC)和颈部胸导管引流+SAP组(DC)动物模型。观察胰腺、肺脏组织病理切片、肺脏扫描电镜;应用生化法检测血清胰淀粉酶(AMY)、胰脂肪酶(LIP);应用自动血气分析仪检测动脉血气分析。第三部分:胸导管结扎/引流对重症急性胰腺炎时动脉血中性粒细胞功能影响的实验研究取样来自第二部分腹主动脉血(取动脉血气同时)应用流式细胞术(Flow Cytometry,FCM)检测动脉中中性粒细胞功能变化。第四部分:重症急性胰腺炎并发肺损伤时胸导管淋巴液中TNF-α、IL-10、AMY、LIP及内毒素浓度变化的实验研究选择健康SD大鼠20只,随机分为2组,每组10只。分别为颈部胸导管引流组+腹部假手术组(Sham)和颈部胸导管引流+SAP组(DC)。建立SD大鼠颈部胸导管引流情况下腹部手术组、SAP组模型,持续引流并分时段及时低温保存淋巴液。应用生化法检测淋巴液/血清中胰淀粉酶(AMY)、胰脂肪酶(LIP);酶联免疫法检测淋巴液/血清中TNF-α、IL-10,反应时间法检测淋巴液中内毒素浓度。结果: 第一部分:大鼠颈部胸导管淋巴引流动物模型的建立 1各组动物模型均成功引出浅乳白色液,外观性状无差异,均为淋巴液。 2颈部胸导管直接组制模成功率明显低于腹部胸导管直接组和颈部胸导管间接组(P0.05); 3腹部胸导管组的淋巴流量较颈部胸导管直接组和颈部胸导管间接组多且差异明显(P0.05)。第二部分:胸导管结扎/引流对SAP并发ALI早期干预的实验研究 1与同时点实验对照组(SO组)相比,SAP各时点腹水量、胰腺病理评分、肺脏病理评分、血清AMY、血清LIP明显升高(P0.01); SAP2h、6h的PaO2与同时点SO组相比明显升高(P0.01),且SAP2h组的PaO2明显高于SAP6h(P0.01),而SAP12h组的PaO2明显高于同时点SO组(P0.01);SAP2h、6h的PaCO2与同时点SO组相比明显降低(P0.01),而SAP12h组的PaCO2明显高于同时点SO组(P0.01);、 2与同时点SAP组(干预对照组)相比, LC6h组、LC12h组的腹水量、LC6h组的肺脏病理评分、LC2h组血清AMY和血清LIP明显降低(P0.01或P0.05);胸导管结扎组的LC2h组的腹水量、LC2h12h的肺脏病理评分有降低趋势,但无显著差异;LC2h、6h的胰腺病理评分、LC12h的PaO2有升高趋势,但无显著差异,LC12h的胰腺病理评分明显升高(P0.01);LC6h的PaO2明显升高(P0.01)。 3与同时点SAP组(干预对照组)相比,胸导管引流组的DC12h组的腹水量、DC6h、12h的肺脏病理评分、DC2h、6h、12h血清AMY和血清LIP明显降低(P0.01或P0.05);DC2h组的肺脏病理评分有降低趋势,但无显著差异;DC6h、12h的PaO2明显升高(P0.01)。第三部分:胸导管结扎/引流对重症急性胰腺炎时动脉血中性粒细胞功能影响的实验研究 1与同时点对照组(SO组)相比,SAP组各时点CD11b表达阳性PMN比例、PMN呼吸爆发作用(RB)平均荧光强度均明显升高(P0.01);SAP2h的CD11b平均荧光强度与同时点SO组相比有升高趋势,但无显著性差异(P0.05),SAP6h、12h的CD11b平均荧光强度与同时点SO组相比明显升高(P0.01或P0.05),且SAP12h组的CD11b平均荧光强度明显高于SAP6h; 2与同时点干预对照组(SAP组)相比,各时点LC的PMN呼吸爆发作用(RB)平均荧光强度、CD11b表达阳性PMN比例、CD11b平均荧光强度均有降低趋势,但无显著差异。 3与同时点干预对照组(SAP组)相比,各时点DC的PMN呼吸爆发作用(RB)平均荧光强度、CD11b平均荧光强度、DC6h、12h的CD11b表达阳性PMN比例均有明显降低(P0.01或P0.05)。第四部分:重症急性胰腺炎并发肺损伤时胸导管淋巴液中TNF-α、IL-10、AMY、LIP及内毒素浓度变化的实验研究 1 TNF-α,IL-10 1.1淋巴液中、血清中TNF-α 淋巴液中TNF-α水平:腹部假手术各组间Sham(2h)、Sham(6h)、Sham(12h)的TNF-α水平均无明显差异;与同时腹部假手术各组相比,SAP各时点组的淋巴液中TNF-α均明显升高(P0.01);SAP各时点组相比:SAP6h、12h组的TNF-α较SAP2h组均明显升高(P0.01),SAP6h、12h两组之间相比TNF-α水平均无明显差异。血清中TNF-α水平:腹部假手术各组间Sham(2h)、Sham(6h)、Sham(12h)的TNF-α水平均无明显差异;与同时腹部假手术各组相比,SAP各时点组的血清中TNF-α均明显升高(P0.01);SAP各时点组相比:SAP6h、12h组的TNF-α较SAP2h组均明显升高(P0.05),SAP6h、12h两组之间相比TNF-α水平均无明显差异。正常状态淋巴液中TNF-α浓度与血清中TNF-α浓度在对应时点均无明显差异;DC组淋巴液中TNF-α浓度与血清中TNF-α浓度在对应时点亦均无明显差异。 1.2淋巴液中、血清中IL-10 淋巴液中IL-10水平:腹部假手术各组间Sham(2h)、Sham(6h)、Sham(12h)的IL-10水平均无明显差异;与同时点腹部假手术各组相比,SAP各时点组的淋巴液中IL-10水平均明显升高(P0.01);SAP各时点组相比:SAP6h组的IL-10水平较SAP2h组均明显升高(P0.01);SAP12h组的IL-10水平较SAP2h、6h组均明显升高(P0.01)。血液中IL-10水平:腹部假手术各组间Sham(2h)、Sham(6h)、Sham(12h)的IL-10水平均无明显差异;与同时腹部假手术各组相比,SAP各时点组的血清中IL-10水平均明显升高(P0.01);SAP各时点组相比:SAP6h组的IL-10水平较SAP2h组均明显升高(P0.01);SAP12h组的IL-10水平较SAP2h、6h组均明显升高(P0.01)。正常状态淋巴液中IL-10浓度与血清中IL-10浓度在对应时点均无明显差异;DC组淋巴液中IL-10浓度与血清中IL-10浓度在对应时点亦均无明显差异。 2 AMY ,LIP 2.1淋巴液中AMY 淋巴液中AMY水平:腹部假手术各组间Sham(2h)、Sham 6h)、Sham (12h)的AMY水平均无明显差异;与同时腹部假手术各组相比,SAP各时点组的淋巴液中AMY均明显升高(P0.01);SAP各时点组相比:SAP6h、12h组的AMY较SAP2h组均明显升高(P0.05),SAP6h、12h两组之间相比AMY水平均无明显差异。 2.2血清中AMY 腹部假手术各组间Sham(2h)、Sham(6h)、Sham(12h)的AMY水平均无明显差异;与同时点的腹部假手术各组Sham(2h)、Sham (6h)、Sham (12h)相比,SAP各组SAP 2h、6h、12h各组的淋巴液中AMY均明显升高(P0.01);SAP各时点组相比:SAP6h、12h组的AMY较SAP2h组均明显升高(P0.05),SAP6h、12h两组之间相比AMY水平均无明显差异。DC组淋巴液中AMY浓度在对应时点明显高于与血清中AMY浓度(P0.01)。 2.3淋巴液中LIP 淋巴液中LIP水平:腹部假手术各组间Sham(2h)、Sham(6h)、Sham(12h)的LIP水平均无明显差异;与同时腹部假手术各组相比, DC组各时点的淋巴液中LIP均明显升高(P0.01);DC组各时点相比:SAP6h、12h组的LIP较SAP2h组均明显升高(P0.01),SAP6h、12h两组之间相比LIP水平均无明显差异。 2.4血清中LIP 血清中LIP水平:腹部假手术各组间Sham(2h)、Sham(6h)、Sham(12h)的LIP水平均无明显差异;与同时腹部假手术各组相比, DC组各时点的血清中LIP均明显升高(P0.01);DC组各时点相比:SAP6h、12h组的LIP较SAP2h组均明显升高(P0.01),SAP6h、12h两组之间相比LIP水平均无明显差异; DC组淋巴液中LIP浓度在对应时点明显高于与血清中LIP浓度(P0.01)。 3淋巴液中内毒素水平变化 Sham各时点(2h、6h、12h)间没有明显差异;DC 2h与Sham各时点(2h、6h、12h)间相比没有明显差异;DC6h、DC12h与Sham组对应时点相比明显升高,有明显差异(p0.01);DC6h、12h与DC 2h相比明显升高,有明显差异(p0.01);DC12h与DC6h相比明显升高,有明显差异结论第一部分:大鼠颈部胸导管淋巴瘘动物模型的建立 1颈部胸导管间接组制模成功率最高,其次是腹部胸导管组,颈部胸导管间接组与腹部胸导管组操作成功率差异不明显(P0.05);颈部胸导管直接组较另外两组操作成功率低(P0.01)。; 2三种方法引流的淋巴液无明显性状差异;腹部胸导管组在引流量方面明显多于颈部胸导管直接组、颈部胸导管间接组(P0.01),这可能是由于腹腔淋巴循环对腹腔骚扰较敏感造成的,说明腹部胸导管引流技术明显影响腹腔淋巴循环。 3大鼠颈部间接胸导管引流法可稳定引流淋巴液,且不骚扰腹腔,是稳定、可靠、制模成功率高胸导管引流动物模型制作方法,能够用于SAP并发ALI时与淋巴循环有关的实验研究。第二部分:胸导管结扎/引流对SAP并发ALI早期干预的实验研究 1 SAP早期即可引起肺脏损伤性病理形态学变化,随后可进一步出现其功能障碍。 2颈部胸导管引流能够减轻SAP引起的急性肺损伤病理形态学变化及其功能障碍,而颈部胸导管结扎有减轻SAP引起的急性肺损伤病理形态学变化及其功能障碍的趋势:在早期(2h,6h)颈部胸导管结扎、引流,两者相比对肺功能的改善差异不明显;到中后期(12h)颈部胸导管引流较结扎能够明显减轻SAP引起的急性肺损伤病理形态学变化及其功能障碍。 3颈部胸导管引流没能减轻SAP时胰腺病理形态学变化,而颈部胸导管结扎能加重SAP时胰腺病理形态学变化第三部分:胸导管结扎/引流对重症急性胰腺炎时动脉血中性粒细胞功能影响的实验研究 1颈部胸导管引流能够降低SAP时主动脉血中PMN的呼吸爆发作用、CD11b表达阳性PMN比例、CD11b平均荧光强度;而颈部胸导管结扎有降低SAP主动脉PMN的呼吸爆发作用、CD11b表达阳性PMN比例、CD11b平均荧光强度的趋势。 2颈部胸导管结扎/引流能够影响SAP时主动脉血中PMN的呼吸爆发作用、CD11b表达阳性PMN比例、CD11b平均荧光强度,这可能是颈部胸导管引流能够减轻SAP引起的急性肺损伤病理形态学变化及其功能障碍的原因。第四部分SAP合并ALI时胸导管淋巴液内AMY、LIP、TNF-α、IL-10、内毒素水平变化的实验研究 1 SAP合并ALI时发病过程中淋巴液中内毒素浓度、AMY、LIP、TNF-α、IL-10浓度明显上升。 2 SAP合并ALI时胸导管淋巴液中成分复杂,可能通过激活的胰酶、内毒素TNF-α、IL-10等直接或间接的用过活化中性粒细胞,损伤肺组织。 3 SAP合并ALI时AMY、LIP浓度在淋巴液中与血清中相比,两者之间差异明显,据此,淋巴液中的AMY、LIP是导致血清中该物质浓度上升的来源之一。 4 SAP合并ALI时TNF-α浓度在淋巴液中与血清中相比,两者之间无明显差异,IL-10也是如此;据此,淋巴液中的TNF-α、IL-10不是导致血清中该物质浓度上升的来源。 5反应时间法(鲎试剂法之一)是测定淋巴液中内毒素含量的可靠方法。
【学位授予单位】：河北医科大学
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2009
【分类号】：R657.51;R563.8

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