气管活性物质及免疫抑制剂对大鼠气管平滑肌细胞电压依赖的L-钙通道的作用

发布时间：2020-08-24 19:58

【摘要】： 支气管哮喘是一种常见病，且近年来发病率有增长趋势。目前认为该病是由炎性细胞引起的一种气道慢性炎症，此种炎症使易感者对各种激发因子具有气道高反应性。研究支气管哮喘的关键在于探明气道高反应性的产生机理。以往，有关气道高反应性的研究多以受体及炎性细胞为基础，但尚不能完全解释哮喘的发病机理。膜片钳技术的出现，使人们可直接观察细胞膜上单通道的活动，从而为哮喘的研究在分子水平上开辟了一个新领域。目前对气管平滑肌的通道研究多集中在钾通道上，由于其容易记录，故研究者相对较多，而对于与兴奋-收缩耦联有密切关系的钙离子通道的研究，由于其电导小，电流幅度较低，记录难度大，研究者较少。细胞内钙离子浓度的升高对增加和维持气道平滑肌细胞收缩力起重要作用。而细胞外钙离子主要通过电压依赖性钙通道(voltage dependent caicium channel，VDCC)进入细胞。钙通道对调节支气管平滑肌兴奋-收缩耦联起主要作用。涉及气管平滑肌上钙离子通道的研究工作尚不多见，迄今对其全部类型、分布、通道活动和细胞内调控因素特性仍不甚了解，更缺乏与哮喘相关的钙通道改变的报道。当前急需用膜片钳技术更深入地研究。其中包括：气管平滑肌上存在的钙通道的类型?支气管舒张剂及免疫调节剂有无对抗作用?哪类支气管舒张剂特异性较强?这正是本课题的研究方向，它将扩充哮喘发病机制的传统概念。为寻找新型的、具有高选择性的抗哮喘药物亦有应用价值。本实验分成三个部分进行研究。 1．哮喘与缺氧大鼠模型的制作；气管平滑肌细胞(trachea smooth muscle cell，TSMC)急性酶分离及正常情况下L型钙通道(L-type calcium channel，Ⅰ_(Ca-L)的记录。 2．哮喘大鼠TSMC上的Ⅰ_(Ca-L)的记录及免疫抑制剂对Ⅰ_(Ca-L)的作用。实验中将雄性Waistar分为正常对照组、哮喘组、哮喘大鼠用火把花根片(Huobahuagen tablet，HBT)治疗组及哮喘大鼠用地塞米松(dexamethasone，DXM)治疗组共四组，分别给予相应的处理，观测大鼠支气管平滑肌细胞Ⅰ_(Ca-L)在正常时，哮喘发作时，以及给予HBT及DXM治疗后的变化。 3.慢性缺氧(Chronieh即oxia，CH)大鼠TSMC上的I。。一L的记录及溟化异丙托对CH大鼠TSMC上的I。。一。的治疗反应情况。实验中将雄性Wai star分为正常对照、缺氧组及缺氧用异丙托嗅胺处理组共三组，分别给予相应的处理。观测大鼠支气管平滑肌细胞工。。一:在正常时、缺氧时、以及缺氧后给予滨化异丙托品处理后的变化。结果显示: 一、TSMC的单离子通道 (一)、TSMC的分离及鉴别取健康wistar大鼠体重30电359，以2%戊巴比妥钠腹腔注射麻醉，断头处死后快速开胸取气管立即置于含有混合气的HPPS的溶液中清冼，去除周围结缔组织、血管、软骨环、刮去内膜。用HPSS液清冼2~3次。用1 .Omg.ml一‘ 链酶蛋白酶在36℃孵箱中消化15一ZOtnin，在此期间HPSS液中通95060:与5%C。: 的混合气体。用HPSS清冼，彻底去除残余的酶。用两个针头将气管平滑肌分离成丝状，再用吸管反复吹打(10一20次)使细胞游离。将含细胞的液体吸入离心管竖立约Zmin，让未散开的大块组织下沉，取上部细胞悬液置于4℃冰箱备用.将细胞悬液分装到涂有多聚赖氨酸的小培养皿中，静置30min，选用细胞膜完整，有立体感，梭形，折光好的细胞作通道记录。通过倒置显微镜、药物刺激及。一aCtin抗原检测证实为TSMC。 (二)、单通道电流幅度及电导细胞贴附式:玻璃微电极尖端与细胞膜紧密接触，形成高阻封接，其阻抗数值可达10一IOOGQ，由于阻值如此之高，故基本上可看成绝缘，其上之电流可看成零。本实验选用阻抗值5G的电流予以记录。 1)、去极化时，均见明显的内向电流活动。电流幅度在同一钳制电压及刺激脉冲下基本相同，呈时间不等的矩形方波。其幅度分布直方图呈对称的单峰状，并能很好地进行正态分布拟合。无论开放时程长短，通道幅度基本一致。 2)、单通道内向电流，在一定范围内，随去极化程度增大而缩小。根据电流- 电压关系变化的曲线，结果显示该通道电导为24.3PS，这与文献报道工。。一。的电导为25PS较一致(n二16)。 (三)、通道动力特性及鉴定 1.通道开放时间通道开放时程直方图均呈指数分布，且符合双指数拟合。在一7OmV的钳制电压及OmV的刺激脉冲下及控制载体为90蒯BaCI:时，两个开放时间常数下。l (open time constant short eomponen)、T。Zt(oPen time constant long component) 分别为(0.432士0.182)ms、(2.912士1 125)ms(n=12)。 2.通道关闭时间通道开放时程直方图也呈指数分布。在一7OfnV的钳制电压及OmV的刺激脉冲下及控制载体为90耐Bae12时，两个关闭时间常数Te，(elose time constant short eomponent)、T eZ(elose time eonstant long co娜onent)分别为(2 008 士1 167)ms、(5.385士1.926)ms(n=12)。 3.Nifedipine的作用对该通道有高选择性的药物nifedspine【‘〕去阻断它，20一SM的nifedipine 能够完全阻断该通道。从而证实该通道就是工。。一
【学位授予单位】：中国人民解放军第一军医大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2003
【分类号】：R562.25

【参考文献】