脂多糖对大鼠肺微血管内皮细胞src抑制的蛋白激酶C底物表达的影响

发布时间：2020-08-26 02:47

【摘要】： 研究背景肺微血管通透性增高是急性肺损伤(ALI)重要的病理特征和发病机制,这时液体和蛋白由血管腔进入间质间隙和肺泡,形成致命性的肺水肿和呼吸衰竭。急性呼吸窘迫综合征(ARDS)是ALI的严重阶段。因此,肺微血管通透性的研究是ALI和ARDS领域的重要课题,了解血管通透性增高的机制至关重要。引起血管通透性增高的炎症介质大多数是通过改变血管内皮细胞骨架蛋白的含量、分布及功能使血管内皮细胞骨架发生变化,导致内皮回缩,细胞间隙增大,内皮细胞单层通透性增高。src抑制的蛋白激酶C底物(src suppressed C kinasesubstrate,SSeCKS)是一种新发现的细胞骨架蛋白,既往人们对其研究多关注于它在肿瘤发生中的作用,而对它在调控血管通透性方面的作用了解甚少。有文献报道,SSeCKS也是一种炎症反应蛋白。本实验以体外培养的大鼠肺微血管内皮细胞(rat pulmonary microvascular endothelial cells,RPMVEC)为观察对象,用脂多糖(lipopolysaccharide,LPS)诱发炎症反应,观察LPS诱导RPMVEC后SSeCKS的表达变化。目的研究src抑制的蛋白激酶C底物(SSeCKS)在大鼠肺微血管内皮细胞(RPMVEC)上的表达,观察脂多糖(LPS)对RPMVEC中SSeCKS的表达及RPMVEC单层通透性的影响,以及甲基强的松龙的干预作用。方法体外培养RPMVEC,选用RT-PCR和Western blot方法,分别在基因和蛋白水平检测RPMVEC是否表达SSeCKS:引入内参半定量分析,随与LPS孵育的时间及浓度不同,观察RPMVEC中SSeCKS表达的变化。用针头式滤器检测LPS及LPS+甲基强的松龙干预后RPMVEC单层滤过系数(Kf)的变化。结果1.体外成功分离培养出RPMVEC,并经形态学及FITC-BSI结合实验证实。2.用逆转录-聚合酶链反应(RT-PCR)方法从RPMVEC总RNA中扩增出SSeCKS的特异性条带;用Western blot法在RPMVEC细胞蛋白提取液中检测出SSeCKS的蛋白印迹条带。3.正常情况下,RPMVEC中SSeCKS低表达。表达水平变化与LPS呈剂量和时间依赖关系:LPS孵育1h后,RPMVEC中SSeCKS mRNA的表达量随LPS剂量增加而逐渐增高,SSeCKS蛋白水平的变化与mRNA水平的变化相一致;10mg/L的LPS与RPMVEC共同孵育,SSeCKS mRNA表达0.5h开始增高,1h达峰值,之后逐渐降低,12h表达仍高于正常水平,甲基强的松龙干预可抑制LPS诱导的RPMVECSSeCKS mRNA的表达增高;SSeCKS蛋白表达0.5h开始增高,3h达峰值,之后逐渐降低,12h表达仍高于正常水平。4.甲基强的松龙干预可显著降低LPS诱导的RPMVEC单层通透性的增高。结论1.体外成功分离培养RPMVEC,并鉴定为RPMVEC。2.LPS可诱导RPMVEC中SSeCKS表达上调,并呈剂量和时间依赖性。3.甲基强的松龙可降低LPS诱导的RPMVEC单层通透性增高,并下调SSeCKS mRNA的表达,提示SSeCKS与LPS诱导的RPMVEC损伤有关。
【学位授予单位】：安徽医科大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2008
【分类号】：R563.8
【图文】：

倒置显微镜,大鼠,植物凝血素,单层

1.RPMVEC的分离、培养和鉴定倒置显微镜下观察体外培养的RPMVEC，见细胞从组织块游出时多为类圆形、多边形，大小均匀，胞核清晰，胞质丰富(见图1)，生长2一3周时出现单层汇合，呈铺路石样排列;有接触抑制现象，即细胞完全单层汇合后停止分裂;与荧光标记的异植物凝血素结合呈黄绿色荧光(见图2)。

荧光显微镜,大鼠,植物凝血素,单层

大小均匀，胞核清晰，胞质丰富(见图1)，生长2一3周时出现单层汇合，呈铺路石样排列;有接触抑制现象，即细胞完全单层汇合后停止分裂;与荧光标记的异植物凝血素结合呈黄绿色荧光(见图2)。

完整性,安徽医科大学,硕士,片断

RPMVEC总刚A完整性的检验Fig.3IdentitytheintegralityofRPMVECtotalRNA

【参考文献】