骨髓间充质干细胞治疗急性肺损伤的实验研究

发布时间：2020-09-16 13:31

　　急性肺损伤(acute lung injury，ALI)／急性呼吸窘迫综合征(acute respiratorydistress syndrome，ARDS)是临床上比较常见的危重病症，死亡率高达40％。ALI是ARDS的前期。ALI／ARDS的主要病理改变是弥漫性的肺泡-毛细血管膜的损伤，可由严重感染、创伤、休克、酸中毒及有害气体吸入等多种因素引起，临床表现为呼吸窘迫和顽固性低氧血症。除机械通气外，目前对ALI／ARDS的治疗仍缺乏有效的手段。寻找新的治疗措施是目前ALI／ARDS研究中的重点。上世纪九十年代以来，干细胞研究领域取得了一系列突破性进展，为利用干细胞修复组织损伤，治疗一些疑难和复杂疾病提供了可能性。文献相继报道了干细胞在治疗心力衰竭、糖尿病等方面的一些进展，展示了其作为一种新型治疗手段的良好前景。干细胞是一类具有无限自我更新能力和多向分化潜能的细胞，按发生学来源可分为胚胎干细胞(embryonic stem cell，ESC)和成体干细胞(somatic stem cell)。成体干细胞存在于机体的各种组织器官中，在病理状态或外因诱导下可以表现出不同程度的再生和更新能力。某些情况下，成体干细胞表现出很强的跨系或跨胚层分化潜能，即具有“可塑性(plasticity)”。骨髓(bone marrow)间充质干细胞(mesenchymal stem cells，MSCs)属于成体干细胞，目前报道它具有向成骨细胞、成软骨细胞、成脂肪细胞、上皮细胞、内皮细胞、心肌细胞甚至肝脏细胞和神经细胞等方向分化的多种潜能。而且骨髓间充质干细胞通过骨髓吸取就可以得到，取材容易，并在体外有很大的扩增潜能，因此利用MSCs治疗疾病具有突出的优点。本研究观察骨髓间充质干细胞在脂多糖(Lipopolysaccharide，LPS)诱导的急性肺损伤中的作用，主要进行了以下几方面的工作： 1．小鼠骨髓间充质干细胞的分离、培养和鉴定。取小鼠后肢股骨和胫骨，吸取骨髓进行全骨髓培养，得到MSCs，并做细胞免疫化学染色，检测MSCs特异表面标记。 2．建立LPS诱导的小鼠急性肺损伤模型。利用小鼠咽后壁吸入LPS的方法造成小鼠肺损伤；称重计算肺水肿指数；肺组织切片HE染色观察组织病理改变；ELISA检测肺泡灌洗液和肺组织匀浆中IL-1β含量。 3．供体骨髓间充质干细胞的移植和效果评价。将供体MSCs用Brdu标记后行免疫细胞化学染色，观察细胞核中Brdu标记效果；将标记过的MSCs制成细胞悬液，通过尾静脉移植入肺损伤小鼠体内，移植后4天做肺组织切片进行免疫组织化学染色及双染色观察移植细胞的植入和分化状态；检测肺水肿指数，肺泡灌洗液和肺组织匀浆中IL-1β含量。结果表明： 1、培养的MSCs细胞多呈集落样生长，体积较小，成梭形或柳叶形，细胞核明显，核浆比大。细胞免疫组织化学染色显示，表面标记CD44阳性，而造血系表面标记CD34阴性。 2、吸入LPS后，小鼠出现典型的肺损伤病理改变，炎症细胞浸润，肺泡间隔增厚，毛细血管充血，肺泡内可见透明膜形成，严重者肺泡正常结构消失。损伤小鼠肺水肿指数和肺组织匀浆1L-1β含量明显增加。 3、用Brdu标记小鼠MSCs后，利用抗Brdu单克隆抗体进行免疫细胞化学染色，显示标记的细胞出现Brdu阳性；标记的MSCs移植入同种异体的小鼠肺损伤模型内，小鼠肺部出现外源性MSCs，这些细胞表现出上皮细胞表型，免疫组织化学双染色显示Brdu阳性细胞也表达上皮细胞标志物——细胞角蛋白(Cytokeratin，CK)。治疗后小鼠与治疗前相比，肺水肿指数和肺组织匀浆IL-1β含量下降。上述研究结果提示：利用全骨髓培养法培养的MSCs特点符合已知MSCs的特征；吸入LPS后小鼠出现典型的急性肺损伤病理改变；将用Brdu标记的外源性MSCs通过尾静脉移植到肺损伤小鼠体内，MSCs可迁移至肺损伤部位，并表现出上皮细胞表型，参与损伤的肺上皮的修复，并减轻肺水肿程度，减少炎症因子释放。
【学位单位】：中国协和医科大学
【学位级别】：硕士
【学位年份】：2007
【中图分类】：R563.8
【部分图文】：

肺组织,小鼠,肺泡

二、小鼠急性肺损伤模型小鼠咽后壁吸入lmglm!的LPSS即172h后，取肺组织进行切片，日E染色，如图3C、30所示，可以观察到与正常肺组织(图3A、3B)相比，损伤肺组织出现炎症细胞浸润，肺泡间隔增厚，毛细血管充血，肺泡管、肺泡腔内可见透明膜形成，严重者肺泡正常结构消失，几乎全部被炎症细胞充斥。 A(X10)B(X20) C(X10)D(X20)图3小鼠肺组织日E染色 Fig3.HEstainingofIungtissue AandB、 HESteiningofnaturaltissueCandD、HEs怕 iningofinjuredtissue取出肺组织，测量肺水肿指数。如图4和图5所示，损伤小鼠肺水肿指数比正常小鼠增加了24.26%，肺组织匀浆IL一

间充质干细胞,单克隆抗体,显色,细胞核

小鼠骨髓间充质干细胞的标记将MSCs用Brdu标记后，用抗Brdu单克隆抗体做免疫细胞化学染色，OAB显显示已被标记的细胞。如图6显示，用Brdu标记的培养MSCs细胞核区显示棕(图6A)，而未用BFdu标记的MSC则不显色(图6B)。A(X20)B(X20)图6免疫细胞化学染色显示MSC的日rdu标记 Fig6.labelingMSCwithBrdubeforeinjeotionA、 labelingMSCwithBrdu， brown15anti一B川uB、 MSCnotlabeledbyBrdu

肺水肿,指数,小鼠,肺组织

Fig3.HEstainingofIungtissue AandB、 HESteiningofnaturaltissueCandD、HEs怕 iningofinjuredtissue取出肺组织，测量肺水肿指数。如图4和图5所示，损伤小鼠肺水肿指数比正常小鼠增加了24.26%，肺组织匀浆IL一，p含量增加了543.5%。

【参考文献】