精氨酸与GRIM-19在呼吸系统疾病中的作用及其机制

发布时间：2020-09-19 15:55

　　研究背景哮喘是由细胞因子参与调节的以嗜酸性粒细胞(EOS)浸润为主的气道慢性炎症性疾病。活化的EOS可释放主要碱性蛋白(MBP)等多种炎性介质,引起局部炎症反应,激发气道高反应性,但以MBP为主的阳离子蛋白引起气道炎症的机制尚不清楚。资料表明气道上皮细胞中MBP可竞争抑制精氨酸进入细胞内,支气管哮喘患者血中精氨酸水平以及它的生物利用度均低于非哮喘患者。研究表明细胞因子可调控炎症反应,在哮喘气道炎症产生和持续过程中发挥重要作用。但在气道上皮细胞中精氨酸对细胞因子的调控及其具体机制尚不清楚。目的研究精氨酸和阳离子蛋白在前炎症因子诱导下,促炎症介质在肺上皮细胞中的表达及其机制,以阐明精氨酸和阳离子蛋白在支气管哮喘发病机制中所起的作用。方法 1.哮喘气道炎症微环境细胞模型的建立为模仿哮喘气道炎症微环境,用前炎症因子肿瘤坏死因子(TNF-α)和脂多糖(LPS)预先将气道上皮细胞激活,制成哮喘气道上皮细胞模型。并且在加入刺激物之前,用不含血清的RPMI 1640再洗1次,以去除内源性细胞因子和排除血清的影响,不加任何刺激物的细胞作为阴性对照。 2.IL-6和IL-8水平及IL-6 mRNA和IL-8 mRNA的测定收集上述细胞培养的上清液,采用酶联免疫吸附法(ELISA)夹心法测定其中IL-6和IL-8水平。mRNA测定运用TriZol提取NCI-H292细胞总RNA,后用斑点印迹法,特殊~(32)P标记探针的杂交法检测IL-6,IL-8和GAPDH mRNA的水平,斑点以磷光计量化,并以看家基因GAPDH的mRNA表达水平校正。 3.阳离子蛋白抑制左旋精氨酸进入细胞内能力的测定 NCI-H292细胞或NHBE细胞过夜培养,Hank's平衡溶解液(HBSS)清洗后,然后在含有不同浓度的多聚左旋精氨酸或MBP的HBSS中培养24小时后,加入~(14)C标记的左旋精氨酸,最后溶解细胞,采用放射免疫分析法(RIA)测定细胞内~(14)C标记的左旋精氨酸,以不含阳离子蛋白作为对照。 4.IL-6 mRNA和IL-8 mRNA降解的测定 NCI-H292细胞在常规培养基中过夜培养,按照实验要求加入刺激物和反应物,细胞培养2小时后,以放线菌素C1终止转录,在0,40,80分钟时测定剩余IL-6,IL-8和GAPDH mRNA的水平,同样以看家基因GAPDH的mRNA表达水平校正。 5.磷酸钙共沉淀法转染NCI-H292细胞首先构建含有IL-6和IL-8基因启动子区域的氯霉素乙酰转移酶(CAT)报告基因的载体,当NCI-H292细胞生长到70%时,将上述载体转染到NCI-H292细胞,培养24小时后按照实验要求加入各种刺激物,18小时收获转染细胞,裂解细胞,用CAT ELISA试剂盒检测各组CAT蛋白的含量。 6.统计学处理所有参数及其比较均采用SPSS11.5软件,实验数据以均数±标准误(SEM)表示。两组间比较采用t检验分析;多样本比较先采用单因素方差分析,两两比较当方差齐时采用LSD方法,方差不齐时采用Dunnett's T3方法;相关分析采用Pearson相关分析,差异比较P≤0.05考虑有统计学意义。结果 1.低水平左旋精氨酸调节肺上皮细胞IL-6和IL-8的表达 1.1不同培养液对NCI-H292细胞IL-6和IL-8表达的影响:因为NCI-H292细胞常规培养基中(RPMI-1640)含有1mM左旋精氨酸,为了解不同培养基对IL-6和IL-8表达的影响,比较NCI-H292细胞在不含精氨酸的最低需要培养基(MEM-A~-)与含1mM左旋精氨酸的MEM(MEM-A~+)和RPMI-1640三种不同培养液中,LPS或TNF-α共刺激后的IL-6和IL-8的表达,H292细胞在RPMI-1640和MEM-A+中产生的IL-6或IL-8水平均无明显差异(所有P＞0.05,IL-6和IL-8),说明左旋精氨酸相同浓度下,RPMI-1640和MEM两种不同培养基的其他成分对NCI-H292细胞的IL-6和IL-8的表达无显著的影响。另外,在MEM-A~-中较MEM-A~+产生更多的IL-6或IL-8,且与TNF-α的浓度成正相关(r=0.604,P=0.001;r=0.730,P＜0.001,IL-6和IL-8),但与LPS无明显相关(r=0.017,P=0.929;r=0.218,P=0.246,IL-6和IL-8)。 1.2不同剂量左旋精氨酸对NCI-H292细胞IL-6和IL-8表达的影响:左旋精氨酸在0到1mM之间,随着左旋精氨酸浓度的上升,IL-6的水平反而下降,两者呈负相关关系(r=-0.513;P=0.03),低水平左旋精氨酸也升高NCI-H292细胞IL-8的水平,然而我们没有发现左旋精氨酸和IL-8呈负相关关系。 1.3低水平的左旋精氨酸可使支气管原代上皮细胞(NHBE)的IL-8表达增高:与MEM-A~+相比较,在MEM-A~-培养基中不加刺激物和LPS组,NHBE细胞产生的IL-8显著高于相应的MEM-A~+培养基组(P=0.001和P=0.003),但对于TNF-α刺激的NHBE细胞的IL-8在两者之间无明显差异(P=0.11)。 2.阳离子蛋白与左旋精氨酸的关系,以及在前炎症因子诱导下促炎症介质的表达 2.1多聚左旋精氨酸在NCI-H292细胞中的作用:多聚左旋精氨酸(≥10μg/ml)显著抑制左旋精氨酸进入NCI-H292细胞内(P＜0.001),多聚左旋精氨酸与LPS联合作用显著升高IL-6和IL-8,特别是当多聚左旋精氨酸为5μg/ml时最显著。IL-6与多聚左旋精氨酸抑制左旋精氨酸的再摄取呈负相关,这种作用并不受LPS的影响(r=-0.662,P=0.001:r=-0.598,P＜0.01)。IL-8的表达略不同于IL-6,这种相关性与多聚左旋精氨酸的浓度密切联系,当多聚左旋精氨酸为0至5μg/ml时,两者同IL-6呈负相关(r=-0.895,P＜0.001);而当浓度为5至80μg/ml时,则呈正相关(r=0.896,P＜0.001)。此外,H292细胞在多聚左旋精氨酸和LPS共培养时诱导IL-6和IL-8的水平与LPS的剂量呈效应关系,然而,多聚左旋精氨酸与TNF-α之间未见协同作用。 2.2 MBP在NCI-H292细胞中的作用:一定浓度的MBP同样抑制左旋精氨酸的再摄取,并且与MBP的浓度呈依赖性(r=-0.737,P＜0.001)。MBP与多聚左旋精氨酸作用类似,MBP与LPS共同作用显著升高IL-6和IL-8;不同的是,只有LPS不存在于培养基中,IL-6和IL-8的水平与MBP抑制左旋精氨酸的再摄取呈负相关(r=-0.752,P＜0.001:r=-0.784,P＜0.001),而当LPS存在于培养基中时,MBP抑制左旋精氨酸的再摄取能力与IL-6和IL-8的水平无相关性(r=0.083,P=0.744;r=-0.080,P=0.752)。 2.3多聚左旋精氨酸在NHBE细胞中的作用:一定浓度的多聚左旋精氨酸(≥10μg/ml)同样阻止左旋精氨酸进入NHBE细胞内(P＜0.001),TNF-α(t=7.264,P＜0.0001;t=6.002,P＜0.0001),而不是LPS明显协同多聚左旋精氨酸释放IL-6和IL-8(t=-1.693,P=0.098;t=-0.738,P=0.464)。 3.多聚左旋精氨酸对LPS诱导的IL-6和IL-8 mRNA的水平的影响与单一LPS相比较,NCI-H292细胞常规培养基中加入多聚左旋精氨酸和LPS后,可显著增高NCI-H292细胞在培养0h、1h、2h、4h、6h和24h的IL-6 mRNA和IL-8mRNA的水平(所有P＜0.05,IL-6和IL-8),特别是在共培养2h时有一显著高峰(P＜0.0001,P＜0.0001:IL-6和IL-8)。 4.多聚左旋精氨酸对IL-6和IL-8启动子转染的NCI-H292细胞的CAT水平的影响多聚左旋精氨酸与LPS共培养组的IL-6-CAT和IL-8-CAT均显著高于LPS和多聚左旋精氨酸组(P＜0.0001,P＜0.0001;P＜0.05,P＜0.05,IL-6和IL-8)。 5.多聚左旋精氨酸作用下的LPS诱导的IL-6和IL-8 mRNA的降解 NCI-H292细胞在多聚左旋精氨酸和LPS共同诱导下的IL-6 mRNA和IL-8mRNA的降解与单一LPS无明显差异(P＞0.05,P＞0.05;IL-6和IL-8)。结论 1.一定浓度的左旋精氨酸抑制NCI-H292细胞和支气管原代上皮细胞促炎症介质的释放: 2.多聚左旋精氨酸不但抑制左旋精氨酸进入NCI-H292细胞和支气管原代上皮细胞内,而且可在LPS刺激后升高IL-6和IL-8的表达,两者之间密切相关,MBP与多聚左旋精氨酸作用类似; 3.多聚左旋精氨酸促进LPS诱导NCI-H292细胞IL-6和IL-8生成增多的机制可能在于转录活性增加,并非由于IL-6 mRNA和IL-8 mRNA降解减少。研究背景肺癌是严重危害人类生命和健康的常见疾病。约70%的肺癌患者在发现时已属中、晚期,如能早期发现可以使患者的5年生存率明显提高。由于肺癌早期或癌前病变时已发生多种基因异常,这些异常改变往往先于临床症状的出现,并在一定程度上成为早期肺癌的分子标志物。维甲酸/干扰素诱导凋亡相关基因19(Grim-19)是一个新发现的细胞凋亡调节基因,参与调节干扰素和维甲酸诱导的肿瘤细胞凋亡,但在肺癌中的表达及其在肺癌早期诊断中的价值尚不明确。目的研究GRIM-19蛋白在炎症肺组织及支气管肺癌组织中的表达和定位,以及与临床病理资料的相关性,以探讨其在肺癌早期诊断中的价值和临床意义。方法 1.免疫组化抗生物素-生物素-过氧化物酶复合物法(SABC)检测肺癌和炎症肺组织GRIM-19的表达选用经纤维支气管镜或CT引导下肺穿刺术取得的32例肺癌组织和10例炎症肺组织,采用免疫组化抗生物素-生物素-过氧化物酶复合物法(SABC)检测GRIM-19蛋白的表达。 2.分析肺癌和炎症肺组织GRIM-19的表达应用JEDA-801D形态学图像分析系统分析上述32例肺癌组织和10例炎症肺组织免疫组化切片,并用光密度(A)值半定量描述其表达水平,进一步比较GRIM-19蛋白在肺癌组和炎症肺组织之间的区别。 3.分析肺癌组织中GRIM-19水平的表达与临床病理特征之间的关系将肺癌组标本GRIM-19蛋白的表达按性别、年龄、吸烟指数、原发灶分期、淋巴结转移、远处转移及临床病理分期等参数进行分组,分析GRIM-19蛋白的表达与临床病理特征之间的关系。 4.采用激光共聚焦技术检测GRIM-19在肺组织细胞内的定位采用激光共聚焦技术对GRIM-19蛋白在各种正常肺组织结构、炎症肺组织及肺癌组织中的定位进行进一步检测。 5.统计学方法应用SPSS11.5统计软件进行分析,数据用均数±标准差描述,两组间比较采用t检验分析;多样本比较先采用单因素方差分析,两两比较当方差齐时采用LSD方法,方差不齐时采用Dunnett's T3方法;相关分析采用Pearson相关分析,P≤0.05认为有统计学意义。结果 1.GRIM-19在各种细胞类型的肺癌和炎症肺组织中的表达 GRIM-19蛋白表达在肺鳞癌组、腺癌组、小细胞肺癌组和炎症组之间存在显著性差异(P＜0.001),鳞癌组、腺癌组和小细胞肺癌组的GRIM-19蛋白的表达均低于炎症组(P＜0.05,P＜0.05,P＜0.001),小细胞肺癌组的GRIM-19蛋白低于非小细胞肺鳞癌和腺癌组(P＜0.01,P＜0.01),但在鳞癌组和腺癌组之间无显著性差异(P＞0.05)。 2.肺癌组织中GRIM-19的表达与临床病理特征之间的关系 GRIM-19蛋白在非小细胞肺癌Ⅰ-Ⅱ期中的表达量显著高于Ⅲ-Ⅳ期患者(P＜0.01),进一步研究发现GRIM-19与非小细胞肺癌的原发灶分期(T)呈负相关关系(P＜0.05),而与区域淋巴结转移(N)或远处转移(M)无显著相关性(P＞0.05,P＞0.05),与肺癌患者的性别、年龄及吸烟指数均无显著相关性(P＞0.05,P＞0.05,P＞0.05)。 3.GRIM-19在各种肺组织中的分布GRIM-19蛋白在正常及炎症肺组织中主要分布于细胞浆;而在肺癌组织中,GRIM-19蛋白除了部分表达在细胞浆之外,主要集中于细胞核。结论 1.GRIM-19在正常肺组织高表达,在炎症肺组织中的表达高于肺癌组织的表达,且与肺癌的组织学分型有一定的关系; 2.GRIM-19在非小细胞肺癌Ⅰ-Ⅱ期中的表达量显著高于Ⅲ-Ⅳ期患者,并与肺癌的原发灶分期呈负相关关系,而与区域淋巴结转移、远处转移、患者的性别、年龄及吸烟指数均无显著相关性; 3.GRIM-19表达降低在肺癌的发展起着重要的作用,在细胞癌变的过程中GRIM-19由细胞浆转入细胞核,GRIM-19在细胞核的表达是肺组织癌变的一个早期和重要的现象,可能会成为肺癌早期诊断的新靶点。
【学位单位】：安徽医科大学
【学位级别】：博士
【学位年份】：2009
【中图分类】：R562.25

【参考文献】