Intelectin在支气管哮喘气道炎症中作用的研究

发布时间：2020-09-22 17:03

　　 哮喘是一种以气道慢性非特异性炎症为本质的常见疾病,具有气道黏液过度分泌、气道高反应性(AHR)、血清IgE增高和气道嗜酸性粒细胞浸润等特征。而现在越来越多的研究证实,不同的趋化因子在哮喘发生的不同阶段发挥着特异性的作用。趋化因子家族控制着白细胞的迁移和激活。根据序列同源性和第一组两个半胱氨酸残基的位置,趋化因子主要分为CC和CXC两大家族[1],哮喘气道中趋化因子主要来源于肺泡巨噬细胞和哮喘气道上皮细胞。哮喘时嗜酸性粒细胞的浸润使得研究主要关注于对其有趋化作用的趋化因子上,例如RANTES/CCL5 ,MCP-4/CCL13, MCP-3/CCL7。而这些趋化因子通过与在嗜酸性粒细胞中高表达的CCR3受体结合而募集嗜酸性粒细胞[2,3]。除了趋化和激活嗜酸性粒细胞外,这些趋化因子还能够影响其他的与哮喘相关的白细胞,例如TH2细胞,嗜碱性粒细胞等。最近研究表明在哮喘持续期的患者的肺泡灌洗液(BALF)中MCP-1,CCL3和CCL5显著升高[4]。我们前期的研究也发现在卵清蛋白(OVA)激发的小鼠哮喘模型的肺组织中MCP-1和MCP-3的转录高峰在第4小时,且在第8和24小时持续升高。 Intelectin属于凝集素家族,分为Intelectin1和Intelectin2,均是在小鼠小肠的Paneth细胞中发现,Intelectin1和Intelectin2具有91%的同源性。人类Intelectin (hIntL)是一种分泌型糖蛋白,包含295个氨基酸及N-端连接低聚糖,其基本结构单位是120kDa的三聚体,其中40kDa多肽由二硫键连接,并且也分为Intelectin1和Intelectin2。研究表明重组的hIntL在Ca~(2+)存在时可以结合D-戊糖和D-呋喃半乳糖残基,并且可以识别诺卡氏细菌表面的呋喃半乳糖,这表明hIntL是一种新型的能识别呋喃半乳糖的凝集素,并在识别宿主的细菌时有一定的作用[5]。最近有研究发现在哮喘患者支气管刷片和肺泡灌洗液中Intelectin表达增加。在以粘液过度分泌和气道高反应性为共同表型的Tg-IL-13、IL-13/Epi和OVA小鼠肺组织中Intelectin表达水平均显著增高,进一步说明Intelectin可能是与哮喘发生相关的基因[13]。我们的前期研究也发现Intelectin1和Intelectin2的表达在小鼠的肺被OVA激发改变后是上调的,且Intelectin基因表达于小鼠过敏性哮喘模型的气道粘液细胞。Th2细胞分泌的细胞因子,IL-13是变应性气道疾病中重要的炎症因子[15,16]。由于Intelectin和其他趋化因子是气道上皮细胞产生的,我们用MLE12细胞,即小鼠的肺上皮细胞去检测Intelectin在IL-13诱导趋化因子表达中发挥的作用。我们发现IL-13增加了MCP-1和MCP-3在MLE12细胞中的表达。IL-13也刺激了Intelectin1和2在MLE12细胞中的表达。此外我们还用了Intelectin shRNA和一种Intelectin的抑制剂-半乳糖,我们发现IL-13诱导MCP-1和MCP-3不论是在mRNA水平还是蛋白水平的表达都需要Intelectin基因。据我们所知,这是第一次研究发现,Intelectin介导IL-13诱导MCP-1和MCP-3上调,但就其具体机制尚不清楚。 为此本课题应用RNA干扰技术下调Intelectin1和2在OVA诱发的哮喘小鼠气道中的表达水平,观察哮喘炎症的变化及炎症介质MCP-1和MCP-3的变化,并用IL-13刺激MLE12细胞,进一步研究Intelectin是否介导IL- 13诱导MCP-1和MCP-3上调的信号通路以及是何种信号通路,旨在为治疗哮喘提供新的思路。本试验主要分为两个部分: 第一部分Intelectin在哮喘小鼠气道炎症及炎症介质MCP-1和MCP-3表达中的作用 目的:观察Intelectin在哮喘小鼠气道炎症及炎症介质MCP-1和MCP-3表达中的作用 方法:实验分为三组(1)正常小鼠+阴性对照质粒组,(2)哮喘小鼠+阴性对照质粒组,(3)哮喘小鼠+Intelectin shRNA组。通过滴鼻的方法法将转染试剂和质粒分别滴入各组小鼠鼻内。Real time PCR检测各组Intelectin1,2及MCP-1和MCP-3 mRNA水平的表达情况。免疫组化法检测Intelectin在肺组织中的表达。对各组小鼠肺组织气道进行炎症分数评分,及对各组小鼠肺泡灌洗液中的细胞进行分类计数以观察小鼠肺组织炎症的变化。 结果:Intelectin1,2, OVA + shRNA组较OVA组分别降低72%和59%, P 0.05; MCP-1, MCP-3, OVA + shRNA组较OVA组明显降低, P 0.05;BALF中嗜酸性粒细胞计数, OVA + shRNA组较OVA组减少76%, P 0.05 ;OVA组炎症分数明显高于对照组, P 0.01,OVA + shRNA组较OVA组炎症分数显著降低, P 0.05,以上均有统计学意义。 结论:抑制Intelectin后MCP-1和MCP-3表达水平降低,哮喘小鼠的气道炎症减轻,嗜酸性粒细胞减少。 第二部分Intelectin在IL-13诱导的小鼠肺上 皮细胞MCP-1和MCP-3表达中的作用和机制 目的:探讨Intelectin在IL-13诱导的小鼠肺上皮细胞炎症介质MCP-1和MCP-3表达中的作用和机制 方法:用IL-13分别干预MLE12细胞并转染Intelectin shRNA,实验分为三组(1)对照+阴性对照质粒组, (2) IL-13 +阴性对照质粒组,(3) IL-13 + Intelectin shRNA组。用Real time PCR检测Intelectin1和2, MCP-1和MCP-3 mRNA的表达;用Western-Blot检测ERK1/2和P-ERK1/2蛋白水平的变化。用IL-13和PD98059分别干预小鼠肺上皮细胞株MLE12细胞。实验分为三组(1)对照组,(2) IL-13组,(3) IL-13 + PD98059组,然后通过Real time PCR检测趋化因子MCP-1,MCP-3 mRNA表达。 结果:IL-13 + shRNA组较IL-13组Intelectin1和2, MCP-1和MCP-3 mRNA的表达均降低,P 0.05;IL-13 + PD98059组MCP-1, MCP-3 mRNA的表达较IL-13组明显降低, P 0.01;IL-13组P-ERK1/2蛋白表达较对照组升高, P 0.01, IL-13 + shRNA组P-ERK1/2蛋白表达较IL-13组降低, P 0.01。 结论:抑制Intelectin可抑制MCP-1和MCP-3的表达。PD98059, ERK1/2的一种抑制剂,可以阻滞IL-13诱导的MCP-1,MCP-3在MLE12中的表达。另外,IL-13的刺激增加了ERK1/2磷酸化,但Intelectin shRNA转染抑制了IL-13诱导的ERK1/2磷酸化。这些数据显示了ERK1/2通路可以调节IL-13诱导MCP-1和MCP-3的表达,IL-13诱导ERK1/2在小鼠肺上皮细胞激活需要Intelectin基因的表达。因此我们可以这样认为,Intelectin基因至少通过促进ERK1/2的激活,可能会参与IL-13诱导MCP-1和MCP-3的表达。
【学位单位】：华中科技大学
【学位级别】：硕士
【学位年份】：2010
【中图分类】：R562.25

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本文编号：2824679