脂多糖和血小板活化因子诱导大鼠肺微血管内皮细胞损伤机制及GRKs对其调控研究

发布时间：2020-10-10 01:38

　　目的：研究脂多糖(LPS)和血小板活化因子(PAF)诱导急性肺损伤(ALI)机制及G蛋白偶联受体激酶(GRKs)对其调控作用，通过观察LPS、PAF诱导大鼠肺微血管内皮细胞(RPMVEC)损伤时单层通透系数(Kf)和F-肌动蛋白(F-actin)的变化，以探讨F-actin在RPMVEC损伤时的作用，并通过观察GRKs的变化对Kf和F-actin的影响，以了解GRKs在炎症诱导细胞损伤过程中的调控作用。方法：在体外分离、培养RPMVEC的基础上，观察不同浓度的LPS、PAF作用RPMVEC不同时相点细胞脱落的情况、HE染色后细胞形态学变化、细胞单层通透性和F-actin的变化，及山莨菪碱、佛波酯(PMA)、灯盏花素的干预作用。采用针头式滤器检测细胞单层通透性，并用流式细胞仪定量检测FITC标记F-actin，采用Western blot观察RPMVEC是否表达GRK2，以及LPS、PAF作用RPMVEC不同时间和山莨菪碱、佛波酯、灯盏花素干预后GRK2的变化。结果：1 成功体外分离培养RPMVEC，并观察到LPS 1μg／ml作用48h、10μg／ml作用12h、100μg／ml作用8h可见细胞脱落和破裂，100ng／ml作用48h仍未见有细胞脱落或破裂，PAF100ng／ml作用48h、1ug／ml作用24h、10ug／ml作用8h、50ug／ml作用30min可见细胞脱落和破裂。HE染色见LPS组、PAF组(剂量分别为10μg／ml LPS、10μg／ml PAF处理12h)，细胞数目较正常组减少，细胞多呈梭形，部分细胞胞体缩小，核浓缩。两组分别加10μg／ml山莨菪碱、50ng／ml佛波酯、50ug／ml灯盏花素(以下各组所加剂量分别与本组相同)后可见：LPS+山莨菪碱组、LPS+佛波酯组、PAF+山莨菪碱组、PAF+佛波酯组、PAF+灯盏花素组细胞数较LPS和PAF组多，细胞形态及细胞核分裂像变化不大，胞浆较丰富，LPS+灯盏花素组较LPS组无明显差别。2 10μg／ml LPS分别作用15、30、60、90、120min，RPMVEC单层的Kf值较对照组显著增高，山莨菪碱组和佛安徽医科大学硕士学位论文波酷组各时相点Kf值显著低于LPS组，灯盏花素组各时相点Kf值与LPS组比较，无显著差异;10林g/ml pAF组30·60·90·12Omin Kf值较对照组显著增高，山蓖蓉碱组各时相点Kf值显著低于PAF组，佛波醋组30、60、gomin Kf值显著低于PAF组，灯盏花素组60、90、120min Kf值显著低于pAF组。3 10协g/ml LpS作用RpMVEC 30min、 60min、gomin，F一aetin值较对照组显著降低，山蓑若碱组和灯盏花素组gomin F一actin值与LPS组相比，无显著差异，佛波酷组90minF一aCtin值显著高于LPS组。 lug/m1LPS作用即MVEC gominF一actin值较对照组显著降低，而山食若碱和灯盏花素可抑制lug/m1LpS作用细胞引起的F一aetin降低。1009/ml pAF组作用即MVEC 3omin、 60min、90min、12OminF一aetin值较对照组显著降低，山蓑若碱组、佛波酷组、灯盏花素组90minF一aetin值均显著高于PAF组。4 Western一blot检测RPMVEC表达 GRKZ;用10“g/ml LpS刺激即MVEC 3omin、6omin、90Inin与正常对照组相比GRKZ表达明显增高;佛波酷30min组、90min组与LPS 30min组、90min组相比GRKZ表达明显增高，组间比较有显著差异;山蓑若碱gomin组、灯盏花素 gomin组与LPS 90min 组相比两者之间无差异。用10协g/ml pAF刺激RpMVEC 3omin、60min·90min与正常对照组相比GRKZ表达明显增高;山蓑若碱90min组与PAF 90min组之间无差异;佛波酷30min，90min组与PAF 30min，90min组相比明显增高;灯盏花素90min组与 PAF 90min组相比显著增高。结论:1成功进行原代培养RPMVEC，鉴定确定为RPMVEC，并观察到LPS、PAF作用于即MVEC可引起细胞脱落及细胞形态学改变。2 LPS、PAF作用于即MVEC可引起 F一actin的解聚和单层通透性的增高。3 LPS、PAF作用RPMVEC不同时相点可引起细胞GRKZ表达增高。4山食若碱可抑制LPs、PAF引起的RPMVEC单层通透性增高及PAF、 lug/ml LPS引起的RPMVECF一actin下降，对PAF、LPS作用RPMVEC引起的GRKZ表达增高无影响。5小剂量PMA可抑制LPS、以F作用RPMVEC单层通透性的增高和 F一aCtin的下降，且可引起LPS、PAF作用RPMVEC的GRKZ表达明显增高。6灯盏花素可抑制PAF作用RPMVEC单层通透性增高和F一actin下降，并能促进PAF作用RPMVEC GRKZ表达的进一步增高，灯盏花素对1009/ml LPS作用于即MVEC的上述各环节无影响，却可抑制lug/m1LPS作用细胞引起的F一aCtin下降。7 RPMVEC的F一aetin的解安徽医科大学硕士学位论文聚可能是RPMVEC单层通透性的增高的原因之一，GRKZ的表达增高可抑制LPS、以F 诱导RPMVEC损伤。
【学位单位】：安徽医科大学
【学位级别】：硕士
【学位年份】：2004
【中图分类】：R563.8
【文章目录】：
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脂多糖和血小板活化因子诱导肺微血管内皮细胞损伤机制及GRKs对其调控研究
    前言
    第一部分 LPS和PAF对大鼠肺微血管内皮细胞形态学的影响及药物干预作用
        材料与方法
        结果
    第二部分 LPS、PAF对RPMVEC单层通透性的影响及药物干预作用
        材料与方法
        结果
    第三部分 LPS、PAF对RPMVEC F-actin的影响及药物干预作用
        材料与方法
        结果
    第四部分 LPS和PAF对大鼠肺微血管内皮细胞GRK2的影响及药物干预
        材料与方法
        结果
    讨论
    结论
参考文献
附录
致谢
综述
照片

【参考文献】