ERK信号通路在组胺诱导的大鼠气道平滑肌细胞增殖中的调控作用

发布时间：2020-10-11 15:05

　　 1.研究背景 支气管哮喘是危害人类健康的常见病,以气道高反应性和气道重构为其主要特点,气道平滑肌增殖是导致哮喘气道重构的重要原因。因此对哮喘支气管平滑肌细胞增殖的研究就成为了热点。目前认为细胞外信号调节激酶信号通路在支气管平滑肌增殖中起到了重要的作用。 2.研究目的 本研究旨在探讨细胞外信号调节激酶(extracellular signal-regulated kinase, ERK)信号通路在组胺诱导的大鼠气道平滑肌细胞(airway smooth muscle cells, ASMCs)增殖中的调控作用。 3.方法 以体外分离、培养的ASMCs为研究对象,加入不同浓度组胺(histanmine, Hist)和PD98059对其进行处理,采用四甲基偶氮唑蓝(MTT)微量比色法检测Hist及ERK信号通路对ASMCs增殖的影响,Western blot检测ERK1/2、磷酸化ERK1/2 (phosphorylated-ERK1/2,p-ERK1/2)蛋白的表达,采用酶联免疫吸附试验(ELISA)测定ASMCs核内NF-κB水平,并对各组进行比较。 4.结果 低浓度和高浓度的Hist均能不同程度刺激ASMCs增殖,100μmol/L时细胞存活率达201.3%;Hist组ASMCs增殖反应与对照组相比显著增加,而Hist+PD980059组ASMCs的增殖反应显著低于Hist组;Hist组ASMCs中的p-ERK1/2蛋白表达较正常对照组明显增强,在加入PD980059后Hist诱导的活化ERK1/2相对于Hist组表达显著下降;Hist处理组NF-κB吸光度值显著高于对照组,Hist+PD98059组NF-κB吸光度值较Hist处理组显著降低。 5.结论 Hist可显著诱导ASMCs增殖,ERK信号通道在此调控中起重要作用,而且还可能参与ASMCs中Hist诱导的NF-κB活化。
【学位单位】：安徽医科大学
【学位级别】：硕士
【学位年份】：2009
【中图分类】：R562.25
【部分图文】：

随机选取部分原代培养细胞，光镜下见大鼠气道平滑肌细胞呈梭形，呈“峰和谷”生长状态，应用平滑肌特异α-actinSP即用型试剂盒进行纯度鉴定，细胞核为卵圆形位于靠近胞质的中央，且气道平滑肌纯度>95%。见图1，从而证实取自大鼠所分离、培养的细胞为气道平滑肌。图1 细胞α-actin免疫细胞化学阳性染色Fig1 Cell α-actin positive staining immunocytochemistry3.2 MTT检测气道平滑肌细胞增殖MTT法常用于检测细胞存活和生长。MTT法的基本原理是：在活细胞的线粒体脱氢酶和细胞色素C的作用下，tetrazolium环开裂能将染料MTT转变为不溶的蓝紫色甲瓒颗粒，后者的生成量与细胞数目和/或细胞活性呈正相关，用二甲亚砜溶解所生成的甲瓒颗粒，通过检测光密度值变化，可间接反映细胞生长、增殖活性及活细胞数量。利用酶标仪测定490nm处的光密度的OD值，结果显示组胺可诱导气道平滑肌增殖，且其增值效应具有剂量依赖性。图2显示

特别是用于蛋白质纯度检测和测定蛋白质分子量。蛋白印迹分析的结果以内参β-actin 进行半定量分析比较各组，结果表明组胺处理组活化形式的p-ERK1和p-ERK2 在大鼠气道平滑肌中的蛋白表达较正常对照组明显增强(图3)，同时其总ERK1和ERK2 的蛋白表达比对照组也略有增强，而在加入PD98059后组胺诱导的活化ERK1和ERK2蛋白表达量显著下降，与对照组无明显差异，而两组总ERK1ERK2蛋白表达量变化不明显。对照组 Hist组 Hist+PD98059组图3 蛋白印迹分析结果Fig3 Western blot analysis3.4 ELISA法测量气道平滑肌细胞的NF-κB水平Sandwich ELISA的原理是将特异性抗体结合到固相载体上形成固相抗体，然后和待检的相应抗原结合形成免疫复合物，洗涤后再加酶标记抗体，与免疫复合物中抗原结合形成酶标抗体-抗原-固相抗体复合物，加底物显色，后用酶标仪检测吸光度值，从而判断抗原含量。通过Sandwich ELISA技术得出数据看出：组胺处理组NF-κB吸光度值显著高于对照组(P<0.01); 组胺+PD98059组NF-κB吸光度值较组胺处理组显著降低(P<0.01)
【参考文献】

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本文编号：2836754