NapsinA基因治疗肺纤维化的体外实验研究及作用机制探讨

发布时间：2020-11-03 23:05

　　 肺纤维化是间质性肺疾病的最终结局,目前尚无控制或逆转病情的有效治疗方法,肺移植是唯一可以延长肺纤维化患者生存期的方法,因其代价昂贵和供体稀缺,所以不能普遍开展。在现代分子生物学和基因工程技术飞速发展的推动下,基因治疗肺纤维化有望成为一种突破性的治疗手段。 肺纤维化被认为是局限于肺部的一种成纤维细胞增殖性疾病,上皮细胞受损直接导致肺纤维化形成,伴或不伴间质炎症,属于上皮-成纤维细胞疾病。依据这个观点,上皮细胞受损后发生上皮—间质转化(epithelial-mesenchymal transition, EMT)转变为成纤维细胞和成纤维细胞增殖是肺纤维化形成的两个主要环节,那么,抑制上皮细胞EMT和后续增殖是治疗肺纤维化的两个有效靶点。 Napsin A是天门冬氨酸蛋白酶家族中的成员之一,在Ⅱ型肺泡上皮细胞中有明显表达。研究发现它除了具有蛋白水解酶活性外,还有调节细胞多种生物学行为的功能。国内外学者研究发现细胞在表型发生转化后,比如恶性转化,Napsin A表达下调,且下调幅度与表型转化程度成正相关,提示Napsin A的缺失可能是细胞表型转化的原因之一,恢复Napsin A的表达或许可以逆转这一过程。也有研究将Napsin A基因导入细胞DNA中发现细胞增殖能力在体内外实验中均受到抑制,Napsin A可以抑制细胞的增殖能力。本课题利用Napsin A抑制细胞表型转化和增殖能力的生物学功能研究其抗肺纤维化作用的价值。 本研究的目的在于： 将Napsin A基因转染至Ⅱ型肺泡上皮细胞系——A549细胞,并构建体外肺纤维化模型,研究Napsin A基因对体外肺纤维化模型的干预作用同时探讨相关机制。 研究方法如下： 1.体外培养A549细胞,予TGF-β1刺激构建体外肺纤维化模型,TGF-β1设置5个浓度梯度,MTT法筛选出最佳浓度,倒置显微镜下观察细胞形态的动态变化确定建模时间。模型构建后用RT-PCR和Western-blot方法检测到细胞上皮标志蛋白和间质标志蛋白的表达以鉴定模型。 2.构建重组慢病毒质粒PLJM1-Napsin A,以Lipofectamine2000TM将PLJM1-Napsin A转染给包装细胞293T细胞,收集病毒悬液感染A549细胞,用抗生素嘌呤霉素筛选出稳定的A549-PLJM1-Napsin A细胞株,并对细胞表达目的基因和目的蛋白进行鉴定。 3.构建体外肺纤维化模型,MTT法及流式细胞术检测Napsin A对A549细胞在EMT过程中增殖能力的影响,模型构建后用RT-PCR和Western-blot方法检测细胞上皮标志蛋白和间质标志蛋白的表达以研究Napsin A对A549细胞EMT的干预作用。 4.构建裸鼠A549细胞肿瘤模型,绘制瘤体生长曲线及计算抑瘤率,瘤体HE染色病理切片观察A549细胞生长情况,体内研究NapsinA对A549细胞增殖能力的影响。 5.Western-blot方法检测A549细胞中整合素信号传导通路的基础分子—黏着斑激酶(focal adhesion kinase, FAK)的表达,探讨NapsinA干预A549细胞增殖和EMT的作用机制。 研究结果如下： 1.构建体外肺纤维化模型,MTT法检测发现A549细胞在浓度为5μg/L TGF-β1诱导时生长速率最大,筛选出TGF-β1最佳浓度为5μg/L;倒置显微镜下观察细胞形态在TGF-β1诱导后第7天完全演变为间质细胞形态,确定第7天为模型完成时间；模型构建完成后,RT-PCR和Western-blot方法检测到细胞表达E钙蛋白明显下调,而纤维连接蛋白和Ⅰ型胶原表达则显著上调。 2.构建重组慢病毒质粒PLJM1-Napsin A,选取5个单克隆行PCR鉴定,均能扩增出Napsin A mRNA条带,大小约为1.2 kb,质粒PLJM1-Napsin A经自动基因测序仪测序,结果与设计序列完全符合,所含目的基因序列准确无误。RT-PCR和Western-blot方法检测A549-PLJM1-Napsin A细胞株表达Napsin A基因和蛋白均明显增加。 3.体外肺纤维化模型中,MTT法检测A549-PLJM1-Napsin A细胞在EMT过程中增殖能力受到抑制,流式细胞术检测发现其细胞周期被阻滞在G0/G1期；A549-PLJM1-Napsin A细胞在模型中其细胞形态间质变、E钙蛋白表达下调趋势、纤维连接蛋白和Ⅰ型胶原表达上调幅度均受到部分抑制,有统计学意义(P0.05)。 4.裸鼠A549细胞肿瘤模型成功构建,A549-PLJM1-Napsi A细胞瘤体生长相对缓慢,抑瘤率达39.8%,瘤体HE染色病理切片观察A549-PLJM1-Napsin A细胞胞体变圆,相对稀疏,核染色质凝集深染。 5.Western-blot方法检测到A549细胞在体外肺纤维化模型中表达FAK显著增加,但转染Napsin A基因后表达FAK增加趋势变小 由此得出以下结论： 1.TGF-β1诱导A549细胞增殖和EMT,成功构建了体外肺纤维化模型。 2.利用慢病毒载体成功构建了A549-PLJM1-Napsin A细胞株,并且稳定持久表达Napsin A mRNA和蛋白。 3.体内外试验结果提示Napsin A对细胞增殖有抑制作用。 4.体外肺纤维化模型实验中,Napsin A可以部分抑制细胞EMT。 5.Napsin A对细胞增殖和EMT的抑制作用与下调FAK表达、抑制整合素信号传导通路有关。
【学位单位】：江苏大学
【学位级别】：博士
【学位年份】：2011
【中图分类】：R563.9
【部分图文】：

图1.1肺泡及肺泡壁模式图Figure1.1Alveoliandalveolarwalldiagram3肺纤维化病理各型肺纤维化虽然起因不同，但纤维化的发展与结局基本相似，即由下症细胞浸润起始，逐步引起肺泡上皮细胞和血管内皮细胞损伤，并伴有促泡上皮细胞和肌成纤维细胞增殖的细胞因子释放，形成成纤维细胞灶，导基质蛋白和胶原沉积，最终引起肺纤维化。早期或急性期可见肺泡壁和间质内淋巴细胞、浆细胞、单核细胞、组粒细胞及酸性粒细胞浸润，此时肺泡腔可以不累及，但也可以有细胞落的肺泡上皮细胞、巨噬细胞等)和纤维蛋白渗出，肺泡间隔内网硬蛋尚未发生纤维化。随着疾病进展，炎症细胞渗出和浸润减少;I型肺泡上皮细胞变性，

江苏大学博士学位论文:NaPsinA基因治疗肺纤维化的体外实验研究及作用机钊探讨病的I几皮一lbJ质转化(epithelial一mesenchymaltra，lsition，EMT)学说(图1.2)。儿等‘’2)研究证实，在实验性肺纤维化模型中，上皮细胞是间质细胞的主要末源。willisBc等‘’3)研究发现肺泡上皮细胞发生上皮一间质转化后转变成兼具胶原分与收缩功能的间质细胞，大大加快了肺纤维化进程。

法，包括:逆转录病毒载体、腺病毒及相病毒载体、疤疹病毒载体等，其中腺病毒外酶基因转移，是目前研究较多的两种载irus)载体属于逆转录病毒载体，是基于人6cien即virustypex，Hxv一i)为基础发展起来较其他传统病毒载体系统而一言具有诸多优，因此慢病毒及其载体的研究近年来成为的一般生物学特性逆转录病毒之一，为RNA病毒。慢病毒在身反转录酶的作用下合成cDNA，再以此c过病毒整合酶作用整合到宿主细胞的染色
【参考文献】

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2 殷茜;黄晓峰;崔光彬;魏经国;;博莱霉素及肺炎双球菌性肺损伤毛细血管内皮细胞间紧密连接的变化及其意义[J];实用放射学杂志;2008年02期

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本文编号：2869233