MicroRNAs作为COPD分级标志物的筛

发布时间：2020-11-15 13:08

　　 背景:慢性阻塞性肺疾病(Chronic obstructive pulmonary disease,COPD)是持续性气流受限为特征的疾病,是全球重要的公共健康问题。在我国患病率高,60岁以上人群患病率高达13~30%,随着老龄化社会的来临,发病率还将持续上升。COPD患者存在临床表现不一、疾病严重性与肺功能的严重程度不完全匹配、病情进行性加重迁延不愈、易并发多种肺内肺外并发症等问题,严重影响患者的生存质量及生存时间。而目前的治疗手段尚不能阻止肺功能的进行性下降,迫切需要开发新的治疗措施延缓疾病的进展。筛选与疾病分级(严重程度)相关的生物学标志物及治疗靶点对COPD患者定制个体化治疗方案有重要指导作用。COPD是环境因素与宿主基因相互作用的多因素疾病,发病机制复杂,疾病缓慢进行性发展。目前普遍认为COPD与单核/巨噬细胞、中性粒细胞、T淋巴细胞引起的炎症反应、氧化应激反应以及蛋白酶与抗蛋白酶失衡等有关,而近年来遗传易感性在COPD中的作用逐渐受到关注。miRNA是具有调控功能的非编码RNA,参与调节许多重要的生物过程如:生长发育、细胞增殖、细胞分化、凋亡等,与肺部多种疾病的发生发展有密切的联系,参与了多种肺部疾病的发病机制。由于mi RNA的稳定性好,在血液中易于检测,并具有特异性强、灵敏度高等特点,有可能成为COPD新型的分子标志物。因此寻找与COPD分级(严重程度)相关的miRNA,可为治疗提供新靶点。进而对于参与疾病生物过程的miRNA进行功能分析,为COPD发病机制的研究提供新的方向,及未来定制个体化治疗方案提供理论基础。研究目的:1.采用小RNA高通量技术,筛选与COPD分级(严重程度)相关的差异表达miRNAs,验证其可否成为生物学标志物及治疗的候选靶点。2.在体外细胞水平阐明候选mi RNA在COPD生物过程中的功能,及其对靶基因的调控机制,探索mi RNA在其发病机制中的作用,为COPD的治疗提供新靶点。研究方法:1.按照2013年gold(globalinitiativeforchronicobstructivelungdisease)指南,选取山西大医院呼吸科门诊2014年1月至2014年12月诊断明确的copd稳定期患者141例,进行综合评估分组。根据入选排除标准最终纳入本研究copd患者共20例,abcd组每组5例。健康对照组6例。所有参与者抽取外周血,分离白细胞,提取总rna,进行小rna高通量测序,运用生物信息学分析筛选copd各组间及临床疾病发展模式中存在的差异性显著性mirna、并进行go和kegg通路分析。候选的mirna采用实时荧光定量pcr法在本地扩大样本的copd患者80例中进行验证。2.在体外通过rt-pcr检测筛选验证的mirnas在人单核thp-1细胞中表达量。构建慢病毒感染细胞,mts活力检测进行mirnas细胞功能的筛选。通过细胞功能学实验(cck-8、pi-facs细胞周期、annexinv-apc细胞凋亡检测)进一步明确mirnas在copd的功能。运用荧光素酶lucifersae检测确定靶向mirna及其靶向基因间是否存在直接调控的作用。结果:1.(1)与健康对照组相比,在copd患者中有1715种表达差异显著的mirnas,包括51种上调的mirnas,18种下调的mirnas。(2)在copdabcd各组中19种mirnas共同呈现差异表达显著,17种mirnas在各组中共同上调。其中mir-106b-5p在a组中表达水平最高,在d组表达水平最低(abcd),而mir-125a-5p在copd组中表达水平明显增高,其中在abc组中其表达量逐渐下降,但在d组其表达量出现转折性增高。(3)在临床疾病发展模式中从a组到b组到d组mir-183-5p的表达水平持续下调。(4)go分析显示大部分的基因功能注释集中在copd生物学过程,如细胞周期、凋亡、代谢、粘附等,部分基因涉及代谢、免疫、应激、细胞信号等。(5)kegg通路分析显示mirna相关靶基因与copd的许多重要信号通路及合并症相关,如细胞自噬的调节,粘着斑,toll-like受体信号通路,癌症相关通路,非小细胞癌,erbb信号通路及p53信号通路等。(6)候选出的mir-106b-5p、mir-125a-5p在本地copd样本中进行实时荧光定量pcr验证,与测序结果一致。2.(1)miR-106b-5p、miR-125a-5p在THP-1细胞中为低表达。(2)成功构建过表达mir慢病毒感染细胞,qPCR检测过表达基因发现miR-106b-5p表达丰度是对照组NC的7.636倍,miR-125a-5p表达丰度是对照组NC的59621.539倍。(3)MTS活力检测结果表明:与对照组NC相比,hsa-miR-125a-5p组的细胞增殖倍数发生了显著的变化(P0.05),而hsa-miR-106b-5p的细胞增殖变化则不明显。(4)CCK-8细胞毒性检测表明:相比对照组NC,mir-125a-5p组在5天时的吸收率变化倍数有显著变化。(5)通过PI-FACS细胞周期检测提示miR-125a-5p-UP组处于S期的细胞数减少(P0.05),G2/M期的细胞数增多(P0.05),使细胞从S期到G2/M期进程加速,促进了细胞的增殖。(6)通过Annexin V-APC细胞凋亡检测,相比对照组,mir-125a-5p组凋亡细胞数无显著差异(P0.05)。(7)Luciferase检测分析miRNA-125a-5p与靶基因IL16的3'UTR结合,抑制靶基因IL16的表达,miR-125a和其靶基因IL16存在直接调控关系。结论:1.miR-106b-5p,miR-125a-5p及miR-183-5p在COPD的发生发展中起重要作用,尤其miR-125a-5p和miR-106b-5p与COPD的疾病严重程度相关。2.miR-125a-5p在人THP-1单核细胞系中功能明显,可促进单核巨噬系统的增殖,调控靶基因IL-16表达下调,通过增强抗炎作用成为COPD的保护因子。3.miR-125a-5p可能成为COPD分级(严重程度)标志物及治疗的新靶点。
【学位单位】：山西医科大学
【学位级别】：博士
【学位年份】：2017
【中图分类】：R563.9
【文章目录】：
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缩略词表
前言
第一部分 COPD患者中miRNA分级标志物的筛选、验证及GO、KEGG通路分析
    1 实验材料与方法
        1.1 实验材料
        1.2 实验方法
        1.3 统计分析
    2 结果
        2.1 患者样本的选择
        2.2 患者样本的miRNA提取及质量鉴定
        2.3 测序数据质量及长度分析
        2.4 miRNA的差异分析
        2.5 miRNA表达谱GO富集分析
        2.6 KEGG通路分析
        2.7 qRT-PCR验证
    3 讨论
        3.1 miRNA的表达差异分析
        3.2 miRNA表达谱GO富集分析
        3.3 miRNA表达谱的KEGG通路分析
    4 结论
第二部分 候选microRNAs的功能分析
    1 实验材料与方法
        1.1 实验材料
        1.2 实验方法
    2 实验结果
        2.1 miRNA表达量的细胞水平验证
        2.2 慢病毒感染细胞
        2.3 qPCR检测过表达基因
        2.4 MTS细胞活力检测
        2.5 CCK-8 细胞活力检测
        2.6 PI-FACS细胞周期检测
        2.7 Annexin V-APC细胞凋亡检测
        2.8 Luciferase检测
    3 讨论
    4 结论
参考文献
综述
    参考文献
附录
致谢
在学期间参与的科研课题与研究成果
个人简历

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本文编号：2884795