长链非编码RNAFantom3_F830212L20调节慢性阻塞性肺疾病相关氧化应激的作用与分子机制研究

发布时间：2020-11-21 10:58

　　 【研究背景】慢性阻塞性肺疾病(chronic obstructive pulmonary disease,COPD)是一种以气流受限为主要特征的,可以预防,可以治疗的疾病。COPD的气流受限具有不完全可逆,呈进行性发展的特点。COPD患病人数多,在世界范围内均有较高的死亡率,造成了严重的社会和经济负担,是全球性的公共健康难题。目前的研究结果表明,慢性烟草烟雾暴露可引发气道以及肺部的异常炎症反应,使中性粒细胞、巨噬细胞等炎症细胞发生活化,导致体内活性氧簇产生增多,DNA双链发生断裂,引起DNA损伤反应,致使肺组织细胞出现衰老改变。同时,慢性烟草烟雾暴露可促使炎症细胞释放TNF-α、IL-1β、IL-6、IL-8等细胞炎症因子,促使更多中性粒细胞、巨噬细胞等炎症细胞浸润肺部。上述炎症细胞在胞吞烟草烟雾等异物后,可分泌更多的促炎因子,后者在活性氧簇以及异物表面抗原分子的刺激下,介导固有免疫应答及适应性免疫应答,进而再次加重肺部的炎症反应。慢性烟草烟雾暴露是COPD发生发展的高危因素,其致病作用已引起临床医师及研究学者的高度关注。长链非编码RNA(Long non-coding RNAs,lnc RNAs)是一类长度大于200个核苷酸的RNA分子,约占非编码RNA的80%,主要由RNA聚合酶Ⅱ转录生成。lnc RNAs可在表观遗传学、转录、转录后等多个层面影响并调控机体中蛋白编码基因的表达。近年来,随着对lnc RNAs功能认识的逐渐深入,越来越多研究表明,lnc RNAs的表达异常与疾病的发生发展密切相关。但目前,关于lnc RNAs与COPD发病的关系尚不清楚。【研究目的】本论文旨在研究lnc RNAs在慢性烟草烟雾诱导的COPD模型小鼠肺组织中的表达变化及生物学功能,为进一步揭示慢性烟草烟雾诱导COPD的病理生理机制提供线索。【研究方法】(1)以LPS联合全身烟雾暴露的方式构建COPD小鼠模型,正常对照组小鼠则饲养于清洁干净环境中。造模结束后,测定两组小鼠肺功能、肺泡灌洗液炎性细胞分类计数、Muc5AC含量、肺组织病理等。并对两组小鼠提取肺组织中的RNA,进行RNA测序及生物信息学分析,并从中选择部分显著差异表达的lnc RNAs及蛋白编码基因进行q RT-PCR验证。通过检索NCBI数据库,获取小鼠lnc RNAs和蛋白编码基因的人类同源分子的碱基序列后,分别在CSE刺激16HBE和A549细胞中,以及COPD患者和健康对照组PBMCs中,进行上述lnc RNAs和蛋白编码基因的q RT-PCR验证。(2)扩大COPD患者的样本量,分别在COPD患者和健康对照者的PBMCs中、烟草烟雾暴露7天和3个月的小鼠肺组织中、CSE刺激mle12细胞中,进行Fantom3_F830212L20和Nqo1的检测。【研究结果】1.lnc RNAs以及其相关的蛋白编码基因在COPD模型小鼠肺组织中的表达变化以及生物信息学分析结果综合COPD模型小鼠和对照组小鼠的肺功能、BALF炎性细胞分类计数、Muc5AC含量以及肺组织病理等结果,评估慢性烟草烟雾诱导COPD模型小鼠构建成功。两组小鼠肺组织RNA测序结果显示,COPD模型小鼠肺组织中lnc RNAs及m RNAs的表达水平,明显不同于对照组小鼠。以fold change2及padj0.05作为判断标准,共有109个lnc RNAs和260个m RNAs在COPD模型小鼠及对照组小鼠肺组织中显著差异表达。将显著表达差异的lnc RNAs可能靶向的蛋白编码基因,与260个显著表达差异的m RNAs进行交集后,共获得44个与lnc RNA相关的,可能受lnc RNAs调控的,且本身也在COPD模型小鼠肺组织中显著差异表达的蛋白编码基因。对这些蛋白编码基因进行GO分析,结果显示这些蛋白编码基因主要富集在细胞对干扰素β反应方面(基因生物学过程)、与GTP结合方面(分子功能)以及细胞浆方面(细胞组分)。KEGG分析结果显示,这些蛋白编码基因主要与内质网的蛋白加工处理以及牛磺酸和亚牛磺酸通路的信号通路有关。化学物富集分析结果显示,这些蛋白编码基因主要富集在烟草烟雾暴露的通路方面。从上述显著表达差异的lnc RNAs和蛋白编码基因中选择相关系数0.95的lnc RNAs和蛋白编码基因对,构建了lnc RNAs-蛋白编码基因的共表达网络图。其次,将本论文研究中显著表达差异的44个蛋白编码基因,与GEO数据库中COPD患者的高通量数据进行交集后发现,IL1R1、UCHL1、GGT5等3个蛋白编码基因同时在COPD模型小鼠肺组织以及COPD患者肺组织和/或PBMCs中显著表达差异。从显著表达差异的lnc RNAs和蛋白编码基因中,共挑选了14个lnc RNAs及14个蛋白编码基因,在另外选取的COPD模型小鼠和对照组小鼠肺组织中进行了q RT-PCR验证分析,结果显示这些lnc RNAs及蛋白编码基因在COPD模型小鼠肺组织中的表达趋势,与RNA测序结果显示的表达趋势一致。2.lnc RNAs人类同源分子以及其相关的蛋白编码基因,在CSE刺激的16HBE细胞、A549细胞以及COPD患者PBMCs中的表达变化通过序列比对分析发现,上述进行了q RT-PCR验证的14个lnc RNAs中,共有11个lnc RNAs能找到人类同源分子。q RT-PCR结果显示,共有8个lnc RNAs人类同源分子(Fantom3_F830212L20、Fantom3_7420409G12、NR_028593、NR_033450、Fantom3_C130011B08、Fantom3_2810049O06、NR_102714、Fantom3_D330021G15)和7个蛋白编码基因(UCHL1、NR1D2、PER3、HLF、AHRR、NQO1、SERPINA3)在CSE刺激的16HBE细胞中的表达趋势,与它们在COPD模型小鼠肺组织中的表达趋势相同;共有7个lnc RNAs的人类同源分子(Fantom3_C130011B08、Fantom3_7420409G12、Fantom3_D830009E10、NR_033450、NR_033355、NR_102714和Fantom3_F830212L20)和7个蛋白编码基因(NR1D2、NQO1、AHRR、GGT5、HSPA5、FKBP4、UCHL1)在CSE刺激的A549细胞中的表达趋势,与它们在COPD模型小鼠肺组织的表达趋势相同;共有2个lnc RNAs人类同源分子(NR_102714和NR_028593)和7个蛋白编码基因(UCHL1、DNAJA1、GGT5、FKBP4、IL1R1、HSPA1A和HSPA5)在COPD患者PBMCs中的表达趋势与它们在COPD模型小鼠肺组织中的表达趋势相同。3.COPD患者、烟草烟雾暴露7天及3个月小鼠的氧化应激指标,以及Fantom3_F830212L20(或其人类同源分子)和Nqo1表达水平的检测COPD患者血浆以及烟草烟雾暴露7天及3个月小鼠肺组织中GSSG等氧化应激指标,较之对照组均有升高趋势。其次,COPD患者PBMCs中Fantom3_F830212L20人类同源分子和NQO1表达量较之健康对照组均有升高趋势,且COPD患者吸烟量与其血浆GSSG水平以及PBMCs中Fantom3_F830212L20人类同源分子和NQO1的相对表达量均呈正相关。此外,烟草烟雾暴露7天及3个月小鼠肺组织中Fantom3_F830212L20、Nqo1 m RNA及蛋白表达水平均高于正常对照组小鼠。4.CSE刺激mle12细胞中Fantom3_F830212L20、Nqo1 m RNA和蛋白表达水平的变化CSE刺激的mle12细胞中Fantom3_F830212L20及Nqo1 m RNA表达水平均随CSE刺激浓度升高而升高,且Fantom3_F830212L20和Nqo1 m RNA相对表达量均随CSE刺激时间延长而呈递减趋势。Nqo1蛋白表达水平则随CSE刺激浓度升高而升高,并随CSE刺激时间延长而升高。以si RNA沉默Fantom3_F830212L20后,在0及0.5%CSE刺激下,mle12细胞内Nqo1 m RNA及蛋白表达水平,以及细胞内GSH水平,均低于对照组。【结论】1.在烟草烟雾诱导的COPD模型小鼠肺组织中,共发现109个lnc RNAs及260个m RNAs显著差异表达。这些差异表达的lnc RNAs相关的蛋白编码基因的生物学功能主要富集在内质网蛋白加工处理以及牛磺酸和亚牛磺酸信号通路。2.Lnc RNA NR_102714(或NR_102714人类同源分子)及其相应的蛋白编码基因UCHL1在烟草烟雾诱导的COPD小鼠肺组织、CSE刺激的气道上皮细胞以及COPD患者外周血PBMCs中均有相同的表达趋势,提示它们可能共同调控COPD的发生发展。3.Lnc RNA Fantom3_F830212L20在烟草烟雾诱导的小鼠肺组织和肺泡上皮细胞中高表达,可能正向调控Nqo1表达,降低烟草烟雾诱导的氧化应激反应。4.在COPD患者PBMCs中,Fantom3_F830212L20人类同源分子和NQO1表达量均高于正常健康者;COPD患者吸烟量与PBMCs中Fantom3_F830212L20人类同源分子和NQO1的表达量均呈正相关。Fantom3_F830212L20人类同源分子和NQO1的调控关系有待进一步研究。
【学位单位】：广州医科大学
【学位级别】：博士
【学位年份】：2018
【中图分类】：R563.9
【部分图文】：

图 2 COPD 模型小鼠肺中，BALF 的炎性细胞分类计数、Muc5AC 含量以及肺泡平均截距Control 表示正常对照组小鼠，CS 表示 COPD 模型小鼠。(a) BALF 的炎性细胞分类计数；(b) BALF 的 Muc5AC 含量；(c) 肺泡平均截距。统计方法为 one-way ANOVA，**P＜0.01N=6。2122232425200.10.20.30.40.50.60.70.80.91Total Neutrophils Macrophages LymphocytesEosinophil******CelnumberinBALfluid(104/ml00.51Muc(foldof0102030405060Averagealveolarintercept(μm)**c Control CSControl CS

44图 4 各个测序标本 RNA 测序数据的质量评估（a）表示测序数据(Raw Data)中带接头的 reads、低质量 reads、包含 N（N 表示无法确定碱基信息）的 reads、包含核糖体 RNA 的 reads、其他不合格的不能用于数据分析的 reads，以及能用于数据分析的有效 reads 的百分比。（b）将有效的 reads 与小鼠参考基因组进行序列比对后统计得到的 reads 在外显子区、剪切区、内含子区、基因间隔区的分布百分比。（c）有效的 reads 在染色体上的分布情况。Sample 1～Sample 3为正常对照组小鼠的肺组织，Sample 4～Sample 6 为 COPD 小鼠模型的肺组织。

46 5 lncRNAs 和 mRNAs 在 COPD 模型小鼠和正常对照小鼠肺组织表达情况的聚类分ncRNAs；(b)mRNAs。热图中，每个小方格表示每个 lncRNAs 或 mRNAs。不同的颜色ncRNAs 或 mRNA 的表达量大小，表达量越大，颜色越深（红色表示表达上调，绿色下调）。每行表示每个 lncRNAs 或 mRNAs 在不同样本中的表达量情况，每列表示每
【参考文献】

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1 王品;非编码RNA对人NK细胞与树突状细胞免疫功能的调控作用及相关机制研究[D];第二军医大学;2013年

本文编号：2892909