核因子κB活化与成纤维细胞表型转化在肺间质纤维化中的作用

发布时间：2020-11-22 03:54

　　实验目的间质性肺疾病(ILD)是由200余种疾病组成的一类疾病,他们在临床表现、实验室和病理学改变上具有一定共同特点,但又有各自不同的特征。成纤维细胞活化、增殖及大量细胞外基质聚集是肺纤维化的主要病变特征,多种因素均可引起肺纤维化,如职业性粉尘(SiO_2等)、病毒(冠状病毒等)、放射性损伤及某些药物(博莱霉素等),此外还有一类不明病因的肺纤维化—特发性肺纤维化。虽然起因不同但纤维化的发展与结局基本相似,目前肺纤维化发生的确切机制尚不清楚,早期有效防治亦未获得突破性进展。核因子-κB(nuclear factor-kappa B,NF-κB)是大多数细胞因子表达的一个关键性转录调控因子,NF-κB的活化与肺间质纤维化发病关系密切,阻断NF-κB活化有可能是治疗肺间质纤维化的重要手段。NF-κB抑制蛋白(inhibitory NF-κB,IκB)是胞浆内NF-κB的抑制物,对NF-κB的功能具有重要的调节作用。成纤维细胞转化为表达α-平滑肌动蛋白的肌成纤维细胞在肺间质纤维化病理过程中具有重要作用。本文旨在研究NF-κB的活化对肺成纤维细胞向肌成纤维细胞转化的影响,以及在这一过程中,IκB对NF-κB的调节作用,从而为肺间质纤维化的防治提供理论依据。实验方法 1、动物模型的建立、分组将12只C57BL/6雌性小鼠(8周龄、体重18-20克、无特殊病原体SPF级、北京维通利华实验动物技术公司)随机分成两组,每组6只。小鼠10%水合氯醛(3ml/kg)腹腔注射麻醉后,无菌手术暴露气管,模型组气管内注入博莱霉素A5(5mg/kg、日本化药株式会社、批号:Y60520、溶于20μl的无菌生理盐水)。对照组气管内注入生理盐水20μl。 2、细胞培养两组小鼠分别于气管内注射处置后第1及第3天随机取3只。用组织块贴壁法原代培养肺组织成纤维细胞,并传4代。 3、成纤维细胞的鉴定倒置显微镜下观察培养过程中细胞的形态变化;免疫细胞化学方法鉴定波形蛋白和角蛋白的表达。 4、检测指标及方法对原代培养并传4代的细胞爬片进行p65、IκB-α及α-SMA免疫细胞化学染色以检测各指标蛋白的表达,用原位杂交检测p65及IκB-αmRNA的表达。并用MetaMorph图像分析系统对免疫细胞化学及原位杂交结果进行定量分析。分析各指标间相关性,研究成纤维细胞α-SMA的表达与NF-κB的关系。实验结果 1、原代培养的成纤维细胞特征典型,并通过传代培养得到了纯化的成纤维细胞。培养细胞形态学变化:第3～4代细胞形态较为均一,呈长梭形,显微镜下可见1～2个核仁;细胞之间界限清晰,呈鱼群状或栅栏状排列。 2、免疫细胞化学鉴定结果:免疫细胞化学检测原代细胞表达波形蛋白强阳性,角蛋白散在灶性个别细胞弱阳性;第4代细胞均表达波形蛋白强阳性,角蛋白呈阴性表达。 3、在博莱霉素诱导的肺间质纤维化的病理过程中,p65、IκB-α和α-SMA的蛋白及p65、IκB-α的mRNA表达均较对照组的表达明显增强(P＜0.01)。 4、p65与IκB-α的蛋白表达呈正相关(r=0.801,P＜0.05),与α-SMA蛋白表达呈正相关(r=0.764,P＜0.05);p65与IκB-α的mRNA表达呈正相关(r=0.731,P＜0.05)。结论 1、采用组织块帖壁培养法成功地培养了肺成纤维细胞。 2、肺纤维化模型动物存在成纤维细胞向肌成纤维细胞的表型转化,肌成纤维细胞的持续存在是肺纤维化发生的关键因素之一。 3、核因子κB活化可能在成纤维细胞向肌成纤维细胞表型转化中起关键性作用,并因此在肺间质纤维化中发挥重要的作用。 4、IκB-α通过抑制NF-κB的活化发挥抗纤维化的作用。
【学位单位】：中国医科大学
【学位级别】：硕士
【学位年份】：2008
【中图分类】：R563.9
【部分图文】：

肺成纤维细胞,小鼠,角蛋白,阴性