hsa-miR-181a靶向TLR4调控THP-1巨噬细胞表达炎症介质

发布时间：2017-04-14 17:17

  本文关键词：hsa-miR-181a靶向TLR4调控THP-1巨噬细胞表达炎症介质，由笔耕文化传播整理发布。

【摘要】：目的：预测并拟定靶向作用于TLR4基因（TLR4mRNA）的miRNA。观察所拟定的miRNA对巨噬细胞表达炎症介质的影响并探讨其机制。 方法：通过生物信息学方法分析TLR4mRNA3′端非翻译区（3′UTR）序列的二级结构，同时利用在线预测工具预测并结合相关文献拟定可能靶向作用于TLR4基因的miRNA。通过ELISA测定巨噬细胞培养基中TNF-α、IL-1β、IL-6含量。采用qPCR检测巨噬细胞内拟定miRNA相对表达量。使用RT-PCR测定巨噬细胞内TLR4、TNF-α、IL-1β、IL-6mRNA表达水平。通过western blot检测巨噬细胞内TLR4蛋白水平。运用荧光素酶报告基因技术分析拟定miRNA与TLR4mRNA的靶向结合活性。 结果：⑴经生物信息学预测并结合相关文献拟定miR-181a作为靶向调控TLR4基因（TLR4mRNA）的待验证miRNA。⑵在巨噬细胞被转染2.5nM、5.0nM、10.0nM的miR-181a mimic及对照的mimic，待0h、24h、48h、72h后,再分别予LPS刺激(时限为6h)，发现miR-181a mimic转染组培养基中TNF-α、IL-1β、IL-6含量均较相应对照组及0h组显著降低（均P＜0.05），尤其以5.0nM、48h组最为明显；但当巨噬细胞被转染2.5nM、5.0nM、10.0nM的miR-181a inhibitor及对照的inhibitor时，0h、24h、48h、72h后,再分别予LPS刺激(时限为6h)，则发现miR-181a inhibitor转染组培养基中TNF-α、IL-1β、IL-6含量均较其对照组及0h组显著升高（均P＜0.05），其中以5.0nM、48h组最为明显。⑶在巨噬细胞分别被转染5.0nM的miR-181a mimic（或对照的mimic）和miR-181a inhibitor（或对照的inhibitor）48h，接着予LPS刺激6h后，发现miR-181a mimic转染组与其对照组相比，细胞内miR-181a相对表达量显著升高（P＜0.05），而miR-181ainhibitor转染组与其对照组相比，细胞内miR-181a相对表达量显著降低（P＜0.05），同时发现miR-181a mimic和miR-181a inhibitor处理组与各自对照组相比，细胞内TLR4mRNA表达水平均无显著差异（均P＞0.05），但miR-181a mimic处理组与其对照组相比，细胞内TLR4蛋白水平及TNF-α、IL-1β、IL-6mRNA表达水平均显著降低（均P＜0.05），而miR-181a inhibitor处理组与其对照组相比，细胞内TLR4蛋白水平及TNF-α、IL-1β、IL-6mRNA表达水平均显著升高（均P＜0.05）。⑷通过荧光素酶报告基因技术发现：miR-181a mimic转染组T293细胞内荧光素酶活性显著低于对照组（P＜0.05）；miR-181a mimic+miR-181ainhibitor共转染组T293细胞内荧光素酶活性显著高于miR-181a mimic转染组（P＜0.05）。 结论：①hsa-miR-181a可通过下调TLR4表达，负向调控THP-1巨噬细胞表达炎症介质。②hsa-miR-181a通过与TLR4mRNA3′UTR直接结合，，阻遏TLR4mRNA翻译，抑制TLR4基因表达。
【关键词】：hsa-miR-181a toll样受体4 THP-1巨噬细胞 炎症 急性肺损伤
【学位授予单位】：南华大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2013
【分类号】：R563
【目录】：

• 中文摘要5-7
• Abstract7-10
• 前言10-13
• 第一部分 生物信息学预测13-17
• 1. 原理13
• 2. 方法13-14
• 2.1 TLR4 mRNA 3′UTR 序列获取及其二级结构分析13-14
• 2.2 Targetscan 预测以 TLR4 为靶基因的 miRNA14
• 2.3 MiRDB 预测以 TLR4 为靶基因的 miRNA14
• 3. 结果14-16
• 3.1 TLR4 mRNA 3′UTR 序列及其二级结构14-15
• 3.2 Targetscan 预测结果15
• 3.3 MiRDB 预测结果15-16
• 4. 小结16-17
• 第二部分 体外细胞实验验证 miR-181a 下调 TLR4 表达，抑制巨噬细胞表达炎症介质17-41
• 1. 实验细胞17
• 2. 主要试剂17-18
• 3. 主要仪器与器材18-19
• 4. 实验方法19-30
• 4.1 高表达 TLR4 细胞株的选取19-20
• 4.2 细胞培养20
• 4.3 转染及 LPS 刺激20-21
• 4.4 细胞上清液的收集21
• 4.5 ELISA21-22
• 4.6 总 RNA 提取22-23
• 4.7 qPCR 与 RT-PCR23-25
• 4.8 蛋白提取及定量25-26
• 4.9 western blot26-27
• 4.10 相对荧光素酶活性法检测 miR-181a 与 TLR4 mRNA 的靶向结合活性27-30
• 5. 实验结果30-41
• 5.1 ELISA 测定的培养基中 TNF-α、IL-1β、IL-6 含量30-34
• 5.2 qPCR 检测的细胞内 miR-181a 相对表达量34
• 5.3 RT-PCR 检测的细胞内 TLR4 mRNA 表达水平34-35
• 5.4 western blot 检测的细胞内 TLR4 蛋白水平35-36
• 5.5 RT-PCR 检测的细胞内 TNF-α、IL-1β、IL-6 mRNA 表达水平36-39
• 5.6 荧光素酶报告基因技术检测的 miR-181a 与 TLR4 mRNA 的靶向结合活性39-41
• 讨论41-44
• 结论44-45
• 参考文献45-47
• 主要英文缩略语索引47-48
• 文献综述48-53
• 参考文献51-53
• 硕士期间发表的论文53-54
• 致谢54-55
• 基金资助55

【参考文献】

中国期刊全文数据库 前1条

1 李琦,钱桂生,张青,王长征;不同剂量脂多糖对大鼠急性肺损伤效应的观察[J];第三军医大学学报;2004年10期

  本文关键词：hsa-miR-181a靶向TLR4调控THP-1巨噬细胞表达炎症介质，由笔耕文化传播整理发布。

本文编号：306482