IL-4RA基因转染阻止了哮喘模型的炎症发展

发布时间：2021-03-30 18:35

　　本实验的目的是针对哮喘模型进行基因治疗,IL-4和IL-13是诱发哮喘的关键细胞因子,IL-4、IL-13的受体重叠性构成一个复杂的共刺激信号,可以诱导STAT6的磷酸化。IL-4-STAT6途径在B细胞IgE型转换的过程中起到重要的作用,IL-13也可以激活STAT6途径并诱导IgE的生成。经证明鼠IL-4变异体C118（C末端118以后的氨基酸删除）蛋白有效的阻止了IL-4和IL-13诱导的信号传导和IgE水平,同时也阻止了过敏性气道嗜酸细胞浸润和AHR。目前鼠IL-4的双变异蛋白Q116D/Y119D（IL-4受体拮抗剂-IL-4RA）经证明可以阻止哮喘模型肺组织中STAT6的磷酸化,同时也阻止了过敏性气道嗜酸细胞浸润、气道高反应性和血浆IgE水平的升高。本实验就是采用能够拮抗IL-4和IL-13的IL-4变异体（Q116D/Y119D）-IL-4RA对哮喘模型进行基因治疗。首先用IL-4的突变引物对刺激后的BALB/C小鼠脾细胞悬液用RT-PCR的方法实现了IL-4突变基因扩增,随后将目的基因IL-4RA克隆入逆转录病毒真核表达载体并检测其在真核细胞BHK-21中的表达,然后利... 

【文章来源】：吉林大学吉林省 211工程院校 985工程院校 教育部直属院校

【文章页数】：114 页

【学位级别】：博士

【部分图文】：

逆转录病毒转染及包装Fig.1:Transfectionandpackagingforretrovirus

.3 IL-4RA 重组逆转录病毒的滴度测定[101]行滴度测定的前一天，将 NIH3T3 细胞以 1×105传代于 6 孔板l待细胞生长至50%-80%汇片时，弃掉原培养液，加入1ml含有L 病毒上清的新鲜培养液，37℃下温浴 4h，然后再加入新鲜培养培养 48h，将细胞 1 10 传代于新的 6 孔板中，加 G418（500μ 天，记数所形成的克隆数，按如下公式计算滴度：G418 抗性 CFU病毒原液的体积（ml）×稀释度。.3 高滴度重组病毒的筛选已知滴度的重组逆转录病毒，筛选出滴度最高的重组病毒-80下一步实验研究。结果 G418 对于 PA317 细胞的最小致死剂量测定状态良好的 PA317 细胞在含有不同浓度 G418 的培养液中G418 浓度大于 200μg/ml 细胞皱缩死亡（结果见 3-1）。

染滴度测定 NIH3T3 细胞在含有不同浓度 G4大于 400μg/ml 细胞皱缩死亡，G41l。感染正常生长的 NIH3T3 细胞后，胞死亡，被病毒感染的细胞获得 GT3 细胞克隆染色后的结果。图 3-2 PA317 细胞克隆PA317 clone transfected by recombinant repLNC-IL-4RA after G418 selection selec


本文编号：3109957