肺炎嗜衣原体Ⅲ型分泌系统效应蛋白的预测、筛选及免疫活性研究

发布时间：2021-08-02 23:44

　　目的:预测、筛选肺炎嗜衣原体（Chlamydophila pneumoniae,Cpn）III型分泌系统（Type III secretion system,T3SS）效应蛋白编码基因,并研究其免疫活性,探讨预测的T3SS效应蛋白重组蛋白在临床Cpn血清学诊断中的应用价值。方法:①通过生物信息学分析结合相关文献报道,预测Cpn T3SS效应蛋白编码基因;②以Cpn AR39菌株总RNA为模板,RT-PCR从转录水平分析Cpn T3SS效应蛋白编码基因在感染细胞的表达情况,并筛选出在感染后72小时有表达的基因;③PCR扩增预测Cpn T3SS效应蛋白编码基因,将其亚克隆至原核表达载体pGEX-6P-2中构建重组质粒pGEX-6P-2/目的片段,经PCR、测序鉴定后将其转化至表达宿主菌E.coli BL21中,IPTG诱导表达。采用SDS-PAGE和Western blot分析和鉴定表达产物;对温度、IPTG和时间等诱导表达条件进行系列的优化后,获得可溶性表达蛋白并大量诱导表达。GST纯化树脂纯化重组蛋白,用tris8.0将目的蛋白透析降低谷胱甘肽浓度,BCA法测定蛋白浓度;用重组蛋白包被... 

【文章来源】：南华大学湖南省

【文章页数】：64 页

【学位级别】：硕士

【部分图文】：

预测基因的RT-PCR分析·Fig1.RT-PCRanalysisofpredictedgenes

图 2：PCR 产物 1%琼脂糖电泳分析Fig 2. Electrophoretic analysis of PCR product in 1% agarose gel..1.Cpn1022； 2.Cpn0962； 3.Cpn0423； 4.Cpn0710； 5.Cpn0422；6.Cpn0322; 7.Cpn0704； 8.Cpn0810； 9.Cpn0425； 10.Cpn0960；11.Cpn04314. 原核表达载体的构建及鉴定4.1 核苷酸序列分析 Blast 分析：将重组质粒进行序列测定，BLAST 软件对测序结果与 GenBank 上登录的编码序列进行比对，结果表明扩增的 11 个目的基因序列与登录号为 GenBank 上基因完全一致，无一碱基突变，且密码子读码框架正确。列举 Cpn0960 测序结果及分析结果

Query 77 GVFDCRPLIRQELLLESDCFEECSGQGCPERKNILKFLEDRKKHEGNSPFEYL 129GVFDCRPLIRQELLLESDCFEECSGQGCPERKNILKFLEDRKKHEGN+PFEYLSbjct 61 GVFDCRPLIRQELLLESDCFEECSGQGCPERKNILKFLEDRKKHEGNNPFEYL 1135.pGEX6p-2/目的基因重组质粒的诱导表达与鉴定5．1 pGEX6p-2/目的基因重组质粒的诱导表达将重组质粒转化至 E.coli Bl21 表达宿主菌，进行诱导表达。SDS-PAGE 结果显示：诱导菌在相应位置处有明显条带，与预期的分子量相符（图 3）。


本文编号：3318500